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【目的】本课题旨在观察DMP-1、E11、Sclerostin在高磷诱导的残肾大鼠血管钙化模型及高磷诱导的钙化血管平滑肌细胞中的表达,试图阐明CKD血管钙化的可能机制。通过硫代硫酸钠对高磷诱导的残肾大鼠的早期干预,探讨硫代硫酸钠对CKD血管钙化的防治作用及其可能机制。【方法】1.35只SD雄性大鼠分别行5/6肾切除(n=21)或假手术(n=14),术后开始给予高磷或正常磷饮食16周。动物分为5组:(1)假手术+正常磷饮食(SNP);(2)假手术+高磷饮食(SHP);(3)残肾+正常磷饮食(NNP);(4)残肾+高磷饮食,即血管钙化模型组(NHP);(5)残肾+高磷饮食+硫代硫酸钠治疗组(THP)。正常磷饮食配方为:磷(0.9%),钙(1.2%),高磷饮食配方为:磷(1.2%),钙(1.6%),硫代硫酸钠予以腹腔注射,每周三次,对照组予以同等体积无菌注射用水腹腔注射。16周后,大鼠处死前测量尾动脉血压,收集尿量检测24h尿蛋白,取血检测血肌酐、尿素氮、血钙、血磷,ELISA法检测血清iPTH。处死后,取胸主动脉,采用HE、Vonkossa和茜素红染色检测血管钙化程度,采用免疫组织化学方法和Western blot检测血管E11蛋白表达。RT-PCR方法检测DMP-1、E11、Sclerostin mRNA表达,Real-time PCR方法检测血管DMP-1mRNA表达。2.组织块贴壁法原代培养VSMC,倒置相差显微镜观察细胞形态及α-SMA免疫组化鉴定;3~8代VSMC用于实验,分为空白对照组(0.9mmol/L)、正常磷(1.3mmol/L)组、高磷(2.6mmol/L)组,培养第6天,通过茜素红染色检测钙沉积情况, RT-PCR和Real-time PCR技术检测DMP-1、E11、Sclerostin mRNA表达情况、Western Blot检测E11蛋白表达情况,所有实验至少重复3次。【结果】1.高磷饮食16周后,与SNP大鼠相比,NHP组大鼠血肌酐、尿素氮、血磷、尿蛋白、iPTH以及动脉血压明显升高(P<0.05)。经硫代硫酸钠治疗后,THP组大鼠血清肌酐、尿素氮、均较钙化组明显下降(P<0.05)、血磷浓度、尿蛋白、iPTH以及血压均下降(P<0.05)。Von kossa染色显示,16周后SNP和SHP组大鼠主动脉未见明显的黑色钙盐沉积物, NNP组仅出现散在点状黑色钙盐沉积物,而NHP组大鼠主动脉出现明显的点状及线状的黑色钙盐沉积物,经硫代硫酸钠治疗后,THP组血管黑色钙盐沉积物明显减少。茜素红染色与Von kossa染色结果一致,阳性结果为橘红色钙盐沉积物。RT-PCR显示,与SNP组相比,NHP组血管DMP-1、E11、Sclerostin的mRNA表达明显升高(P<0.05),经硫代硫酸钠治疗后THP组血管DMP-1、E11、Sclerostin的mRNA表达较NHP组降低(P<0.05)。Real-time PCR显示,与SNP组相比,NHP组血管DMP1mRNA表达明显升高(P<0.05),经硫代硫酸钠治疗后THP组血管DMP1mRNA表达较NHP组降低(P<0.05)。免疫组化染色显示,与SNP组相比,NHP组血管E11表达明显增加(P<0.05),经硫代硫酸钠治疗后,THP组血管E11表达较NHP组明显减少(P<0.05)。Westernblot显示,与SNP组相比,NHP组血管E11蛋白表达明显升高(P<0.05),经硫代硫酸钠治疗后THP组血管E11蛋白表达较NHP组降低(P<0.05)。2.在高磷诱导的VSMC中,茜素红染色结果显示,与空白对照组和正常磷组相比,高磷组钙盐沉积明显升高(P﹤0.05)。RT-PCR和Real-Time PCR结果同样显示,高磷组VSMC DMP-1、E11、Sclerostin mRNA表达明显增加(P﹤0.05)。Western Blot检测VSMC E11蛋白表达,高磷组较空白对照组和正常磷组明显增加(P﹤0.05)。【结论】1.5/6肾切除手术加高磷饮食喂养16周,可成功建立残肾大鼠血管钙化模型;高磷条件可在体外成功诱导大鼠VSMC钙化。骨细胞标志性蛋白DMP-1、E11、Sclerostin在钙化的血管和VSMC中表达增加,提示血管钙化过程中血管平滑肌细胞最终向骨细胞样细胞转分化。2.硫代硫酸钠早期干预组DMP-1、E11、Sclerostin的表达降低,提示硫代硫酸钠可能通过下调来DMP-1、E11、Sclerostin的表达来减轻血管钙化。