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抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物体经诱导产生的一类具有广谱抗菌活性和免疫调节活性的小分子多肽。如何提高抗菌肽对病原菌的靶向性,从而提高其抗菌效率,减少或避免对正常菌群的破坏作用,是目前备受关注的一个科学问题。因此,设计特异性杀灭某种病原菌的靶向抗菌肽尤为重要。近年来的研究揭示了来自鼠疫耶尔森氏菌(Yersinis pestis)的一种蛋白毒素鼠疫菌素(Pesticin,Pst),结构解析发现它由两个结构域组成—结合域和杀伤域,结合域可以与Fyu A特异性结合,发挥靶向性作用。Fyu A是一种完整的外膜蛋白,也是一些耶尔森菌、致病性大肠杆菌的主要毒力因子。特异性靶向抗菌肽(Specifically targeted antimicrobial peptide,STAMP)技术是一种特异性靶向抗菌肽的设计方法,通过连接一个靶向区域和一个抗菌肽杀伤区域,构建一种新的肽类抗生素,可以靶向作用于特定病原体。基于上述理论依据,将本实验室牛蛙皮肤中分离抗菌肽catesbeianin-1作为研究对象。首先,catesbeianin-1的生物信息学分析表明,catesbeianin-1是一个含有25个氨基酸残基,带电数为+4,以α-螺旋为主要结构的两亲性小肽。通过柔性连接子连接catesbeianin-1与Pst的靶向结合域,设计了4个杂合肽:BD-catesbeianin-1、T-catesbeianin-1、T1-catesbeianin-1、T2-catesbeianin-1,并分析其理化性质和结构,发现它们均为以α-螺旋为主要结构的两亲性抗菌肽。利用SUMO作为分子伴侣,将4个改良肽在大肠杆菌表达系统中进行了融合表达。利用大肠杆菌表达系统成功地表达了融合蛋白SUMO-BD-catesbeianin-1、SUMO-T-catesbeianin-1、SUMO-T1-catesbeianin-1、SUMO-T2-catesbeianin-1。利用SUMO蛋白酶切除融合蛋白的分子伴侣,成功得到了目的蛋白BD-catesbeianin-1、T-catesbeianin-1、T1-catesbeianin-1、T2-catesbeianin-1。通过微量稀释法测定了改良肽的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),结果表明BD-catesbeianin-1对金葡菌、枯草芽孢杆菌的作用减弱,其MIC均比母本肽升高了2倍,对fyu A+大肠杆菌的作用比母本肽增强了4倍;T-catesbeianin-1对金葡菌和沙门菌的抑菌作用增强,其MIC都比母本肽降低了2倍;T1-catesbeianin-1对鼠伤寒沙门菌的抑菌活性显著增强,而对大肠杆菌的作用明显减弱;T2-catesbeianin-1对猪链球菌的抑菌效果提高了2倍。大部分改良肽的MBC比MIC高2-8倍。对人红细胞溶血率的测定结果表明,改良肽BD-catesbeianin-1、T-catesbeianin-1的溶血率与catesbeianin-1的差异不显著(P>0.05),而T1-catesbeianin-1的溶血率显著高于catesbeianin-1(P<0.01),在200μg/m L的浓度下可以达到80%。利用微生物种群的作用分析以及激光共聚焦扫描显微镜观察,筛选出了一个具有靶向性的改良肽BD-catesbeianin-1,并将其与大肠杆菌分离株作用,结果表明其靶向作用与菌株fyu A的携带情况一致。通过扫描电镜观察BD-catesbeianin-1对大肠杆菌细胞形态的影响,发现BD-catesbeianin-1作用后的大肠杆菌细胞表面开始变得不平整,有凸起或者凹陷,进而出现孔洞,最后导致细胞崩解,内容物溢出。NPN试验和ONPG试验表明,BD-catesbeianin-1能增强大肠杆菌细胞膜的通透性。流式细胞仪(FACS)分析显示BD-catesbeianin-1破坏了大肠杆菌细胞膜的完整性。live/dead backlight bacterial viability kit检测到大肠杆菌细胞膜上形成了孔洞。Di SC3-5荧光探针分析表明BD-catesbeianin-1使大肠杆菌的细胞膜发生了去极化。动物机体是一个十分复杂的系统,其内环境可以对进入机体的药物的分布、代谢产生很大的影响,因此,本论文以小鼠为动物模型,研究了BD-catesbeianin-1的急性毒性,并评估了BD-catesbeianin-1对感染E.coli小鼠的治疗效果。综上所述,靶向肽BD-catesbeianin-1可以靶向于表达外膜蛋白Fyu A的大肠杆菌,发挥特异性作用,为其作为靶向治疗致病性fyu A+大肠埃希氏菌感染的新型候选药物奠定了理论基础。