论文部分内容阅读
含笑属(Michelia Linn,)植物是一类实用价值极高的珍贵木本资源,它所包含的种类的多少及其在木兰科中的分类地位长期以来是争议的焦点。本研究根据刘玉壶1984、1995及1996年增订的木兰科分类系统,以木兰科含笑属(41个种)、木莲属(4个种)、华盖木属(1个种)、木兰属(13个种)、盖裂木属(1个种)、单性木兰属(1个种)、拟单性木兰属(3个种)、长蕊木兰属(1个种)、合果木属(1个种)、观光木属(1个种)及鹅掌楸属(1个种)共11属68个种为实验材料,进行ISSR分子标记实验,建立了9属63个种的稳定反应体系,对9属63个种进行分子系统分析,并结合它们的形态学特征,首次从分子水平上探讨了木兰科含笑属与其相关属及含笑属内种间的系统分类地位及之间的亲缘关系,旨在为含笑属植物的系统分类、揭示各个种之间的亲缘关系提供分子信息,为该属的起源、演化和生物地理学问题探讨、多样性认识以及有效保护和可持续开发利用提供理论基础和科学指导。研究内容及结果如下:
1.DNA的提取:以含笑属中金叶含笑的叶片为实验材料,分别采用了CTAB法、改良CTAB法、简易提取方法、高盐沉淀法和SDS法等5种方法提取金叶含笑叶片的基因组DNA,并通过外观观察、琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计及ISSR扩增4种方法对所提取的DNA样品进行检测。DNA纯度、含量比较以及扩增结果表明:5种方法中简易提取法和SDS法提取的DNA纯度较高,高盐沉淀法得到的DNA产量较高;5种方法提取的DNA用于ISSR扩增,其扩增结果基本一致。鉴于简易提取方法操作简单,省时省力,因此采用此法提取金叶含笑及其他各种基因组DNA。
2.反应体系的建立:以金叶含笑(含笑属)、多瓣含笑(含笑属)、马关含笑(含笑属)、日本辛夷(木兰属)、景宁木兰(木兰属)为实验材料,通过对影响ISSR扩增结果的主要因子:Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、taq酶、模板DNA浓度等不同的浓度组合和扩增程序的试验研究,确定ISSR最适反应体系和扩增程序。即在25uL反应体系中包括Md2+1.5mmol/L、4种dNTPs各0.25mmool/L、引物0.4umol/L、Taq酶1U、模板约40ng、10×buffer2.5uL。PCR扩增程序为:94℃预变性5min,然后进行40个循环:94℃变性1min,52-60℃复性45S,72℃延伸2min,循环结束后72℃7min。
3.引物筛选:以金叶含笑为模板,通过对北京奥科公司合成的104条ISSR引物(加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供序列)进行筛选,筛选出11条扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物。ISSR引物及其退火温度分别为:P1、807、820、840(52℃),ISSR20、811、841、860、874(55℃),825、855(60℃)。
4.树系图的建立:基于ISSR扩增条带数据建立了2个UPGMA树系图,一是含笑属与相关属的总UPGMA树系图,二是含笑属属内的UPGMA树系图。根据刘玉壶分类系统(1984,1995及1996增订),在含笑属与相关属的总UPGMA树系图中,63个样本的木兰族和含笑族植物未完全分别聚在一起;在含笑属属内的UPGMA树系图中,含笑属各亚属植物也未完全分别聚在一起。
5.含笑属及相关属的分子系统发育:参照刘玉壶1984、1995及1996年增订的木兰科分类系统,综合木兰科植物11属63种植物的分子系统发育分析结果,支持木莲属、拟单性木兰属、单性木兰属、盏裂木属、长蕊木兰属、观光木属独立成属;木莲属和木兰属的皱种组与天女木兰组亲缘关系较近;建议重新界定木兰属范围,并成立玉兰属;建议将合果木属归入含笑属;建议取消含笑属下亚属和组的划分,设为含笑属。