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本研究分析了不同类型烟草品种及其祖先种腺毛分泌物中赖百当二萜类物质成分及含量的差别,并利用实时定量PCR技术研究了赖百当类二萜合成基因在不同类型烟草品种间与不同烟草组织间的表达规律,进一步通过过表达技术与基因敲除手段初步探讨了赖百当类二萜合成关键基因(NtCPS2)的表达调控机制。主要研究结果如下:1.通过GC-MS分析了不同类型烟草品种和两个祖先种中主要二萜分泌物的种类和含量,结果表明,西柏烷类二萜在各个烟草品种中均有较高的含量;赖百当二萜仅在香料烟云香巴斯玛1号、雪茄烟Beinhart 1000-1与烤烟豫烟11号中存在;两个祖先种中,林烟草仅含有西柏烷类化合物,而绒毛烟草仅含有赖百当类化合物。2.利用超景深显微镜对不同类型烟草品种的腺毛形态进行观察,结果表明,两个祖先种包含的腺毛类型存在差异,其中林烟草包含3种腺毛类型,即长柄腺毛、短柄腺毛和保护毛;而绒毛状烟草包含2种腺毛类型,即长柄腺毛和短柄腺毛,不包含保护毛。5个不同类型的普通烟草品种所包含的腺毛类型也并不完全相同,其中烤烟K326和豫烟11号与林烟草相似,包含3种腺毛类型;而香料烟云香巴斯玛1号、雪茄烟Beinhart 1000-1、白肋烟达白1号与绒毛状烟草相似,包含2种腺毛类型,即长柄腺毛和短柄腺毛。3.分析了赖百当类二萜合成基因在烤烟K326各组织中的表达量,结果表明,赖百当类二萜合成相关基因NtCPS2和NtABS在腺毛中具有较高的表达量,而其他组织中不表达或表达量极低,表明这两个基因在腺毛中特异表达。在不同普通烟草类型间,NtABS基因均有较高表达水平,而NtCPS2基因仅在香料烟云香巴斯玛1号、雪茄烟Beinhart 1000-1与烤烟豫烟11号中有较高的表达量,在烤烟K326和白肋烟达白1号中表达量极低,由此推测,NtCPS2基因表达水平极低可能是导致K326和达白1号中不含赖百当二萜的关键原因。4.在NCBI基因数据库中获得了NtCPS2启动子和NtABS启动子序列,生物信息学分析发现,NtCPS2启动子序列中含有光信号响应元件、脱落酸响应元件、赤霉素响应元件以及与昼夜节律调控因子结合位点,NtABS启动子序列中含有响应光、高温、干旱、赤霉素等信号的顺式作用元件以及与生理调节控制有关的调节元件,暗示这些作用元件可能参与了NtCPS2和NtABS基因的表达调控。将云香巴斯玛1号、K326、8306中NtCPS2基因序列与NCBI数据库中已报道序列进行了比对分析,结果发现,三者的序列与数据库中的序列一致。系统树进化分析结果表明,普通烟草中NtCPS2基因与本氏烟亲缘关系大于马铃薯、番茄等其他茄科物种。将NtCPS2蛋白序列提交到NCBI保守域数据库进行比对,发现该蛋白内存在二萜合成酶保守结构域,由此推测该蛋白参与二萜的合成。5.为了进一步改善烤烟K326的烟叶品质,本研究通过酶切法将该NtCPS2基因与pCAMBIAI1305过表达载体片段构建成重组质粒,最后通过根瘤菌农杆菌介导法将目的基因导入烤烟K326中。通过筛选分化已获得再生植株共10株,下一步将进行阳性植株的鉴定、烤烟K326中赖百当类二萜含量的测定与植株表型的观察。6.为了进一步改良特香型烤烟品种豫烟11号,本研究根据CRISPR/Cas9基因编辑系统的工作原理,选取NtCPS2基因一个外显子区域序列,设计gRNA序列。将gRNA序列与35S:hspCas9:U6:gRNA载体构建成重组质粒,通过根瘤农杆菌介导法对烤烟8306的NtCPS2基因进行基因敲除。对转基因阳性植株的T1代进行测序检测,发现在NtCPS2基因开放阅读框第324碱基处出现一个单碱基插入,导致编码的肽链提前终止。对突变纯合的植株进行植株长势、腺毛形态观察及密度统计、叶面化学成分检测,结果发现,NtCPS2基因的突变并不影响植株的长势与腺毛的密度,但是影响腺毛分泌囊大小;叶面化学成分检测结果表明突变纯合体的腺毛分泌物中缺少赖百当类二萜成分。该结果表明NtCPS2基因的确为赖百当二萜合成途径的关键基因。