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目的:体外探讨全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)是否通过调控micro RNA 200家族(mi R200s)逆转肝癌细胞的上皮细胞间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT),从而抑制肿瘤细胞的增殖迁徙侵袭,促进其成熟分化,并寻找相关下游靶基因,探讨可能的分子生物学机制,为ATRA用于肝癌的临床治疗提供新的思路。方法:以小鼠肝癌细胞Hepa1-6为研究对象,首先体外给予0、0.1、1.0和10.0μmol/L不同终浓度的ATRA处理,台盘蓝拒染实验计数细胞,绘制细胞生长曲线,克隆形成实验、结晶紫染色检测细胞增殖及克隆形成能力;Hoechst检测细胞凋亡,划痕实验检测细胞的平行迁徙能力,Transwell实验检测纵向迁徙及侵袭能力。荧光定量PCR(real-time PCR)法检测肝前体细胞标志甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)及成熟肝细胞标志白蛋白(albumin,ALB)和细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18),酪氨酸转氨酶(tyrosine aminotransferase,TAT),载脂蛋白B(Apo lipoprotein B,Apo B)的m RNA水平表达;Western Blot及免疫荧光检测AFP、ALB、CK18的蛋白水平表达。吲哚菁绿(Indocyanine green,ICG)摄取释放实验及过碘酸希夫(Periodic acid-Schiff,PAS)染色检测细胞的代谢解毒及糖原合成功能。Real-time PCR检测上皮标志蛋白-上皮细胞钙粘蛋白(epithelia cadherin,E-cadherin),以及间质标志蛋白:神经型钙粘蛋白(nerve cadherin,N-cadherin)、锌指蛋白转录因子snail、波形蛋白Vimentin和上皮-间质转化因子twist的m RNA表达。初步筛选出对Hepa1-6细胞作用最佳的ATRA浓度。其次,体外用最佳浓度的ATRA处理Hepa1-6细胞,real-time PCR检测mi R200s的表达情况,筛选出表达变化具有显著差异的mi R200成员mi R200a-3p、mi R200c-3p、mi R141-3p。采用抑制mi RNA200功能的三种特异性mi RNA antagomir处理Hepa1-6细胞,再用最佳浓度的ATRA继续培养细胞,分为:a.空白对照组;b.ATRA组;c.mi RNA antagomir Negative Control(NC)+ATRA组;d.mi R-200s antagomir+ATRA共三组。MTT分析法检测细胞增殖情况,克隆形成实验检测细胞克隆形成,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡,划痕实验检测细胞的平行迁徙能力,Transwell实验检测纵向迁徙能力及侵袭能力,Real-time PCR检测成熟肝细胞标志蛋白ALB、CK18的表达,ICG及PAS染色检测细胞的成熟分化作用。转录因子芯片检测ATRA处理前后345种转录因子活性,获得差异因子,生物信息学分析可能受mi R-200分子调控的差异因子靶基因,并进行real-time PCR法及western blot验证。结果:第一部分:0.1、1.0和10.0μmol/L ATRA处理后Hepa1-6细胞的增殖、迁徙、侵袭能力较control组明显下降(p<0.05),凋亡率增加,ICG摄取及PAS染色阳性细胞数显著增多(p<0.05),上皮标志蛋白E-cadherin,CK18及成熟肝细胞标志ALB、CK18、TAT、Apo B的表达明显上调,肝肿瘤细胞标志AFP下降,间质标志蛋白N-cadherin,Vimentin、Snail、Twist的表达明显下调(p<0.05),这些调节作用呈现出对ATRA的剂量依赖性,10.0μmol/L ATRA组的作用最强。第二部分:1)Real-time PCR结果显示10.0μmol/LATRA诱导后Hepa1-6细胞中mi RNA200a-3p、200c-3p、141-3p的m RNA表达明显上调(p<0.05),而其他7个mi R200家族分子的表达与对照组相比无统计学差异(p>0.05)。2)ATRA处理后Hepa1-6细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭以及成熟分化作用较对照组出现与第一部分相同的作用趋势。NC+ATRA组与ATRA诱导组Hepa1-6细胞的增殖、凋亡率、迁移、侵袭能力、成熟肝细胞标志表达及分化能力均无差异(p>0.05)。而与NC+ATRA组相比,mi R-200a/200c/141-3p antagomir+ATRA三组Hepa1-6细胞的增殖率、划痕愈合率及侵袭细胞均增多(p<0.05),其中mi R-200a/200c-3p antagomir+ATRA两组增多更明显,甚至达到control组水平,但三组克隆形成率均较NC+ATRA组无差异;同时三组凋亡率均较NC+ATRA组均明显下降(p<0.05)。只有mi R-200a/200c-3p antagomir+ATRA两组与NC+ATRA组相比,transwell纵向迁移能力增强,ALB、CK18的m RNA表达下调,PAS及ICG阳性细胞数减少(p<0.05),mi R-141-3p antagomir不影响ATRA对肝癌细胞的纵向迁移和促进分化成熟作用。3)转录因子芯片结果显示ATRA处理后有8个转录因子活性上调,35个转录因子活性下调,生物信息学结果分析mi R-200a/200c/141-3p与klf12、zeb1、Pou4f1、Ets1、Jun基因相关,相对应于AP2、AREB1、Brn-3、Ets1/PEA3及Fra-1/JUN转录因子,而其他7个mi R-200亚型与ATRA调控的43个差异因子均不相关。ATRA诱导后转录因子Jun、Fra-1、Pouf1、Etv4、zeb1的m RNA表达显著下调,klf12表达上调(p<0.05)。并且mi R-200a/200c/141-3p antagomira特异性抑制了mi R-200a/200c/141-3p的生物学作用后,三组较mi RNA Negative control组Jun、Fra-1、Pouf1、Etv4、zeb1的蛋白表达显著上调(p<0.05),Klf12的蛋白表达未见明显改变。结论:ATRA呈浓度依赖性逆转小鼠肝癌细胞Hepa1-6的上皮间质转化,抑制细胞的增殖、迁移及侵袭能力,促进细胞凋亡及成熟分化,并具有成熟肝细胞的合成代谢功能。ATRA可能通过调控mi R-200a-3p、mi R-200c-3p、mi R-141-3p逆转肝癌细胞上皮间质转化,其中mi R-200a-3p、mi R-200c-3p、mi R-141-3p均参与介导ATRA抑制肝癌细胞增殖、平行迁移、侵袭的作用及促凋亡作用;同时mi R-200a-3p、mi R-200c-3p还介导了ATRA抑制肝癌细胞纵向迁移及促进分化成熟的作用,并且mi R-200s调控肝癌EMT的发生可能与Jun、Fra-1、Pouf1、Etv4、zeb1相关。