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目的:脑缺氧/复氧再灌注损伤后,星形胶质细胞表现为肥大、增生等反应性改变,在损伤修复过程中存在“双刃剑”作用。一方面合成、分泌胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),对损伤神经元的修复起重要作用：另一方面过度增生形成胶质疤痕影响神经组织修复。亚低温对脑保护的作用确切,但是机制不明。本课题通过研究亚低温对反应性星形胶质细胞GDNF、CyclinD1及CyclinB1表达的影响从而探讨亚低温对脑缺血再灌注损伤产生保护作用的机制。
方法:利用新生24小时内的SD大鼠,取皮层新鲜脑组织,参照McCarthy等的方法加以改进进行星形胶质细胞(AC)原代培养,调整细胞密度为1.0×105/cm2,接种到含胎牛血清培养基的培养瓶中,置于细胞培养箱内。7-8天后传代,传至第3代,细胞自然纯化后,采用神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光鉴定AC,97％以上为阳性细胞,符合实验要求。将AC分为正常对照组(C)、缺氧/复氧常温组(H/R)、缺氧/复氧亚低温组(H/M+R)。用三气培养箱以95％N2、5％CO2造成细胞缺氧,记缺氧损伤时间,缺氧8小时后分别调节温度37℃及32℃,开始记复氧时间。每组设复氧4h、8h、12h、24h、48h、72h6个时间点,建立AC缺氧/复氧模型。MTT方法测定细胞活力,Brdu染色、流式细胞仪观察细胞增生情况,Westem-blot法半定量分析GDNF、CyclinD1、CyclinB1的表达情况,免疫荧光双标染色观察GDNF与CyclinD1表达情况。采用SPSS16.0统计软件包进行数据分析。
结果:
1.体外纯化培养AC及GFAP鉴定结果:AC传至3代后,细胞胞体较大而扁,突起较多而长,细胞形态不规则,胞核偏于一侧,多为椭圆形,GFAP免疫荧光染色显示绿色。
2.MTT法检测细胞活力:(1)C组细胞活力无明显改变。(2)H/R组与C组比较细胞吸光度下降,细胞活力减低,随着时间延长细胞活力下降明显,差异有统计学意义。(3)H/M+R组与C组比较细胞吸光度下降,与H/R组比较明显增加,细胞损伤减轻,差异有统计学意义。
3.Brdu细胞核免疫荧光检测AC增殖结果:(1)C组细胞未见明显核染色。(2)H/R组GFAP阳性细胞核染色阳性细胞数明显增多,随着缺氧/复氧时间延长呈现增多趋势。(3)H/M+R组与C组比较GFAP阳性细胞核染色阳性细胞数增多,与H/R组比较则减少,差异有统计学意义。
4.流式细胞仪检测AC增殖结果:(1)12h、24hH/R组S期细胞增多。(2)H/M+R组与H/R组比较S期细胞数减少,差异有统计学意义。
5.Western-blot半定量检测结果:(1)C组CyclinD1、CyclinB1、GDNF表达变化不明显,各时间点削无统计学意义。(2)H/R组CyclinD1表达量增多,随着复氧时间延长有增多趋势;CyclinB1表达量增多,于12h、24h增多明显;GDNF先增多,随着复氧时间延长,于12h表达量减少到最低,然后再次开始增多,与C组比较差异有统计学意义。(3)H/M+R组CyclinD1表达量在各个时间点与C组相比差异有显著性,与H/R比较减少,差异有统计学意义,24h后减少明显;与H/R比较CyclinB1各时间点均减少,于12h、24h减少明显;GDNF表达量与C组比较增多,与H/R比较于24h后增多明显,各个时间点与C组比较差异有显著性。
6.GDNF与CyclinD1免疫荧光双标结果:H/M+R与H/R比较GDNF表达增多,CyclinD1表达量相对减少;GDNF免疫荧光强度增加时CyclinD1荧光强度减弱,差异有统计学意义。
结论:
1.缺氧/复氧可以引起星形胶质细胞损伤,活力下降。亚低温可以改善损伤后细胞活力,减轻缺氧/复氧星形胶质细胞损伤。
2.亚低温可以抑制星形胶质细胞反应性增殖,可能与抑制细胞CyclinD1、CyclinB1表达,促进GDNF表达有关。
3.亚低温促进GDNF的表达,GDNF表达与CyclinD1、CyclinB1在时序上有一定的相关性。