论文部分内容阅读
研究目的通过BMP2和BMP7共转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),以富血小板血浆凝胶(PRP)为支架,建立一种可注射型的组织工程骨。研究方法以全骨髓贴壁法分离、得到兔BMSCs,并通过定向分化,细胞表面标志物检测等方法确定为BMSCs。以pAd/CMV/V5-Dest为载体,构建BMP2腺病毒和BMP7腺病毒,并测定病毒的滴度和对兔BMSCs的合适的转染复数值(MOI)。并以Realtime PCR检测转染后细胞BMP2和BMP7基因mRNA表达情况;以免疫荧光检测转染后BMP2和BMP7基因的蛋白表达情况。将分离得到的兔BMSCs传代至第三代,分成五组,分别作以下处理:a、空白对照:继续以常规培养基培养;b、成骨诱导液诱导组:继续以成骨诱导分化培养基培养;c、BMP2基因转染组:单独以BMP2腺病毒进行转染;d、BMP7基因转染组:单独以BMP7腺病毒进行转染;e、BMP2和BMP7基因共转染组:以BMP2腺病毒和BMP7腺病毒进行联合转染。培养第7天、14天以Realtime PCR测定各组细胞Runx-2、Osx、AKP和Collagen I基因的mRNA表达水平;以Western blot测定各组细胞Osteocalcin和Collagen I基因的蛋白质表达水平。以Lendersberg法制备得到PRP,将经过转基因的BMSCs与PRP混合后激活,制备得到组织工程骨,培养1周后对该组织工程骨进行扫描电镜扫描;并将其剪切消化后继续培养。研究结果以全骨髓贴壁法分离得到的兔BMSCs同时具备向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞三个方向分化的能力;其细胞表面表达CD29和CD44,不表达CD14、CD34、CD45和CD90。符合BMSCs的特征。以pAd/CMV/V5-Dest为载体构建的BMP2腺病毒和BMP7腺病毒经扩增后,其滴度分别达到:5×1010 PFUs/ml和2×108 PFUs/ml;其合适的MOI值分别为:200和50。并且病毒转染后7天,BMP2和BMP7在mRNA和蛋白水平均出现明显的表达。经过病毒转染后第7天时,e组在Runx-2、Osx、Collagen I和AKP四个检测指标的mRNA表达中,均较a、b以及c和d组有明显的增高。c、d组在Runx-2、Osx、Collagen I和AKP四个检测指标的mRNA表达中,均较a和b组增高。而c组则在Runx-2和AKP基因上mRNA表达水平要高d组;在Osx和CollagenI基因上mRNA表达水平要低于d组。转染第14天时,e组在Runx-2、Osx、Collagen I和AKP四个检测指标的mRNA表达中,均较a、b以及c和d组有明显的增高。同时,四个检测指标,表达第14天均高于第7天。在进行病毒转染后第7天, e组在Collagen I和Osteocalcin两个检测指标的蛋白质表达中,均较a、b以及c和d组有明显的增高。以Lenderberg法制备的PRP的血小板浓度为全血的3.74倍。兔BMSCs在PRP凝胶中培养7天,其扫描电镜扫描结果见:在PRP的纤维素形成的网状结构中,兔BMSCs可以存活,并较好的附着。将培养7天后的组织工程骨消化后再于10%FBS的DMEM-LG中培养,1d后见培养皿底有梭形以及多角形细胞贴壁,1周后,细胞生长良好,仍然保持梭形以及多角形的形态,并大量增殖。研究结论以全骨髓贴壁法可以分离得到具备多向分化潜能的兔BMSCs。以pAd/CMV/V5-Dest为载体构建的BMP2腺病毒和BMP7腺病毒能够转染兔BMSCs,并共同表达BMP2和BMP7。对兔BMSCs进行BMP2腺病毒和BMP7腺病毒共转染后,较单基因转染和成骨诱导液诱导更能促进成骨相关基因和蛋白的表达。经过转基因的兔BMSCs能够在PRP中存活,生长,增殖。