论文部分内容阅读
我们通过比较基因组研究发现了Mycobacterium tuberculosis(Mt)无毒株H37Ra MazG的A219E突变。MazG属于dNTP焦磷酸水解酶蛋白家族,能够将dNTP类物质水解为dNMP和焦磷酸。前期研究发现Mt MazG不但能够水解正常的(d)NTP,还有降解具有致突变作用的dUTP和8-oxo-dGTP的能力,而MazG[A219E]则丧失了该水解能力,为一个功能丧失突变体。MazG被敲除的Myeobacterium smegmatis(Ms)菌株在双氧水处理下的存活能力比野生株显著下降。我们认为MazG蛋白能够降解特定的氧化损伤型dNTP,从而防止其掺入DNA导致错配和突变的发生。 研究发现,mazG缺失的Ms在氧化条件和稳定生长期下的抗利福平自发突变频率明显高于野生菌株;通过对抗性菌株rpoB基因的测序发现,mazG缺失菌株的C-T突变频率明显高于野生菌株,提示MazG的真正底物应该能够导致C-T突变的发生,如5-OH-dCTP和5-CHO-dUTP等。我们对这些氧化型dNTP进行了酶促动力学常数测定。Mt MazG对5-OH-dCTP的Km值为1.9μM。化学遗传学实验结果显示,向mazG缺失菌株转化5-OH-dCTP后其突变频率显著上升,同时表现出剂量依赖效应,而野生株突变频率则无变化,说明5-OH-dCTP为MazG的真正底物。随后,我们在细胞模型和小鼠模型上研究了MazG与结核分枝杆菌毒力的关系。感染激活的小鼠巨噬细胞系RAW264.7后,mazG缺失的Mt的存活能力低于野生菌株。在小鼠模型上,mazG与Mt持续感染有关:感染小鼠28天之后,缺失mazG的Mt在小鼠脾脏中的存活能力比野生株低1个log单位,肺脏的病理损伤程度显著低于野生株,说明MazG与Mt的体内存活和毒力有关。该研究不但发现了一个新的参与抑制C-T突变的housecleaning相关蛋白MazG,同时揭示了Mt维持其基因组稳定性与体内生存的新机制。