目的:1.以丝素蛋白溶液为原料,采用湿仿法技术,制备环形取向性丝素蛋白(SF)组织工程纤维环支架,并评估其理化性能。2.分离培养兔纤维环细胞,接种到该丝素蛋白纤维环支架,体外构建组织工程纤维环并评估其理化性能。3.利用自行研制的生物反应器研究力学刺激对体外构建组织工程纤维环的影响。方法:1.以丝素蛋白溶液为原料,采用湿仿法制备环形取向性SF组织工程纤维环支架。采用体视显微镜、扫描电镜(SEM)观察支架观察支架表面形态、纤维直径。测定支架的孔径、孔隙率、吸水率。微材料力学性能测试机测定支架压缩弹性模量。2.分离培养兔纤维环(AF)细胞并接种至SF支架上,体外培养一段时间。通过体视显微镜观察细胞-支架复合物的大体形态,SEM、Live/dead染色观察细胞在支架上的黏附、活性和增殖情况。组织工程纤维环分别于体外培养3、7、14天行组织学染色观察,并行总DNA定量分析及蛋白多糖、胶原生化定量分析,同时检测其力学性能的变化。3.利用自行研制的循环灌流力学加载仪对培养的组织工程纤维环进行压缩力学刺激。频率1Hz,压缩幅度分别为组织工程纤维环高度的5%、10%、15%、20%。刺激时间分别为3、7、14天,2小时/天。固定后行组织学切片染色观察,并对总DNA、蛋白多糖和Ⅰ、Ⅱ行胶原进行定量分析,检测不同组之间压缩弹性模量及组织工程椎间盘高度的变化。结果:1.体式显微镜和扫描电镜示支架呈乳白色,中空环形,内径4㎜,外径8㎜,高2㎜。SF纤维排列呈条带状、环形平行取向,纤维表面光滑,均一性好。纤维直径(51.06±9.65)μm,孔隙率(60.37±0.08)%。2.体视显微镜可见细胞支架复合物颜色随时间延长而加深。SEM示细胞粘附在支架上,且分泌大量细胞外基质。细胞及胞外基质随时间增多。Live/dead染色示细胞活性良好,在丝上及孔隙中大量增殖。组织学染色显示细胞及细胞外基质均沿微米纤维取向性分布,且染色阳性强随时间增强;总DNA定量,蛋白多糖、Ⅰ、Ⅱ型胶原生化定量检测显示细胞增殖明显,细胞外基质分泌逐渐增加(P<0.05)。压缩模量随培养时间增加而逐渐增加。3.体视显微镜可见不同型变量组支架细胞复合物颜色均随时间颜色加深,刺激14天后5%、10%、15%形变量颜色最深。组织学HE染色可见不同型变量组细胞及其分泌物均随时间而增值,刺激14天后可见5%、10%、15%形变量组细胞较多。甲苯胺蓝、番红O染色可见GAG分泌随着时间增加而增多,刺激14天后可见5%、10%、15%形变量组明显有GAG聚集。Ⅰ、Ⅱ型胶原染色可见胶原分泌随时间增加而增多,刺激14天后可见5%、10%形变量组有明显的胶原聚集。Ⅰ、Ⅱ型胶原定量检测证明刺激14天后10%形变量组分泌最多。GAG定量证明15%形变量组分泌胶原最多,但是10%形变量组与15%形变量组没有统计学差异。总DNA定量分析可见5%形变量组DNA最高。压缩弹性模量显示20%形变量组最大,但是15%组与其没有统计学差异。力学加载后组织工程椎间盘高度变化没有统计学差异。结论:1.采用湿仿法构建环形取向性SF纤维环支架,孔径、孔隙率适宜,细胞相容性良好,力学性能优越,是较为理想的组织工程椎间盘支架。2.纤维环支架复合兔AF细胞体外培养一段时间后,能够构建出在结构、理化性能上模拟天然纤维环组织的组织工程纤维环;丝素蛋白纤维环支架的生物相容性良好。3.力学环境与纤维环细胞在支架上的增值和分泌关系密切,适宜的力学刺激是纤维环细胞增殖和分泌的有利因素,过度的压缩会加速细胞凋亡。不同检测指标的最适应变幅度有差异,在1Hz频率,Ⅰ、Ⅱ型胶原在最佳压缩幅度10%,GAG和压缩弹性模量最佳压缩幅度15%,DNA最佳压缩幅度5%。