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本论文主要包括三个方面的工作：第一个工作是对腾冲嗜热菌核糖体再循环因子(RRF)的表达，纯化以及表征；第二个工作采用结构域交换构建嵌合体蛋白的方法研究了RRF的结构域功能及分子作用机理；第三个工作研究了腾冲嗜热菌RRF的C末端序列缺失对其结构和功能的影响。
1.腾冲嗜热菌核糖体再循环因子(RRF)的表达，纯化以及表征：作为原核生物体内必需的蛋白质翻译因子，核糖体再循环因子(RRF)在延伸因子G(EF-G)协助下完成蛋白质翻译的第四步：即翻译终止后复合物—含去酰化tRNA，mRNA和70S核糖体—的解体，核糖体被循环再利用。为了研究RRF蛋白的结构与功能关系，我们对腾冲嗜热菌核糖体再循环因子(TteRRF)进行了克隆，表达，纯化及鉴定。测序结果表明，TteRRF基因全长555bp，编码184个氨基酸残基，与大肠杆菌RRF(EcoRRF)有51.4％的氨基酸序列完全一致，68.1％的序列近似。TteRRF蛋白在大肠杆菌细胞内得到了高效可溶表达，使用金属螯合层析的方法得到了很高的纯度。对TteRRF蛋白进行了一系列的性质测定，包括质谱分析，westernblot，体内活性测定等。质谱分析表明TteRRF的分子量为21488，与EcoRRF十分接近。Westernblot结果表明，TteRRF可以与EcoRRF的多克隆抗体间产生相当的交叉免疫反应。体内活性实验则表明TteRRF在大肠杆菌细胞内有微弱的活性。以上实验结果表明，我们得到了腾冲嗜热菌的核糖体再循环因子(TteRRF)，这为我们下一步以此为模型研究其结构与功能关系奠定了基础。
2.采用结构域交换构建嵌合体蛋白的方法研究RRF的结构域功能及分子作用机理：核糖体再循环因子(RRF)在延伸因子G(EF-G)帮助下解体翻译终止后复合物，完成原核生物体内蛋白质翻译的第四步。RRF分子的三级结构外形与tRNA十分类似，由两个相对独立的结构域组成，但其各自的功能仍不清楚。Nakano等人尝试分别表达RRF的结构域Ⅰ和结构域Ⅱ来检测他们各自的功能，结果发现单独表达的结构域Ⅱ由于是包含体而无法测定其活性；结构域Ⅰ与核糖体的结合位点和完整的RRF相同，但却不具有RRF的活性。为了确定哪个结构域在执行RRF的功能中起着主要作用以及哪个结构域在RRF分子稳定性方面起主要作用，本章中以交换大肠杆菌RRF(EcoRRF)和腾冲嗜热菌RRF(TteRRF)结构域的方法构建了两个蛋白嵌合体EcoDⅠ/TteDⅡ和TteDⅠ/EcoDⅡ，并在大肠杆菌细胞中进行了高效可溶性表达。其中，EcoDⅠ/TteDⅡ含有EcoRRF的结构域Ⅰ和TteRRF的结构域Ⅱ;而TteDⅠ/EcoDⅡ则含有TteRRF的结构域Ⅰ和EcoRRF的结构域Ⅱ。通过体外(invitro)及体内(invivo)活性分析，比较两个嵌合体蛋白和两个野生型蛋白解体翻译终止后复合物的功能，结果发现：在大肠杆菌EF-G(EcoEF-G)存在的条件下，TteDⅠ/EcoDⅡ和EcoRRF一样，表现出了完全的解体翻译终止后复合物的活性。而EcoDⅠ/TteDⅡ与TteRRF一样，都没有表现出或者是表现出较低的解体翻译终止后复合物的功能；然而在与TteEF-G共表达的情况下，他们又表现出较高的活性。与核糖体的结合实验表明四个蛋白都能有效的与核糖体结合，排除了EcoDⅠ/TteDⅡ与TteRRF在大肠杆菌体系中无活性是由于EcoDⅠ/TteDⅡ与TteRRF不与大肠杆菌核糖体结合。而胍变性和热变性实验结果表明，TteDⅠ/EcoDⅡ和TteRRF的变性曲线很接近；EcoDⅠ/TteDⅡ和EcoRRF的变性曲线很接近。以上的实验结果不但表明RRF分子的结构域Ⅱ在RRF功能表达中可能起着重要作用，而且提示RRF和EF-G分子之间存在着特异性相互作用；而结构域Ⅱ可能更多地参与了与EF-G的相互作用。结构域Ⅰ则可能主要负责与核糖体的结合及RRF分子的稳定性。两个蛋白嵌合体EcoDⅠ/TteDⅡ和TteDⅠ/EcoDⅡ可在大肠杆菌细胞中高效可溶性表达的这一事实表明，RRF分子构象的完整性对于其正确的折叠是至关重要的，而domainⅡ的正确折叠可能依赖于与domainⅠ有效地相互作用。本章的工作为鉴定RRF两个结构域各自的功能提供了直接的生化证据。
3.腾冲嗜热菌RRF的C末端序列缺失对其结构和功能的影响：RRF的C-末端序列，二级结构成分是α-螺旋，在其三级结构中属于结构域Ⅰ的组成部分，但在空间上更靠近两个结构域间的铰链区域。由于它所处位置的特殊性，引起了研究者们的注意。Fujiwara等人的研究指出，在特定条件下，嗜热菌ThermusthermophilusRRF(TthRRF)在大肠杆菌细胞内没有活性，但是从其C末端去掉5个氨基酸残基(△C5TthRRF)后却表现出了完全的活性。据此他们提出一个假设，TthRRF的domainα(即结构域Ⅰ)在大肠杆菌细胞内可能有潛在的激活功能，而它的这种功能则是由其C-末端的5个氨基酸残基所调控。故而，他们提出TthRRF的C末端残基是一个调节元件(modulatorelement)。为了证实这一论断，Rao等人利用结核杆菌RRFRRF(MtuRRF)和C末端去掉6个氨基酸残基后的突变体(△C6MtuRRF，与△C5TthRRF缺失的氨基酸残基在序列上是对等的)做了同样的工作，结果发现MtuRRF和它的C末端缺失突变体均不能在大肠杆菌细胞内表现出活性。考虑到结核杆菌是嗜温菌，我们不能简单地用Rao等人的结果否定Fujiwara等人的论断。为了进一步探究这一问题，在此我们用TteRRF作为研究模型。如上所述，与TthRRF相似，在特定条件下TteRRF在大肠杆菌细胞内也没有活性，其C末端缺失6个氨基酸残基对等于TthRRF去掉C末端5个残基。那么，TteRRF的C末端6个残基是不是其在大肠杆菌细胞内发挥活性的调节元件(modulatorelement)呢?其C末端序列对整个RRF分子的完整性，稳定性和功能又有哪些影响呢?为了解答这两个问题，我们构建了TteRRF的4个C末端缺失突变体△C6TteRRF，△C9TteRRF，△C12TteRRF和△C15TteRRF，其C末端分别缺失了6个，9个，12个和15个氨基酸残基。4个突变体蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)体系中得到了高效可溶性表达。我们利用活性测定，核糖体结合，圆二色(CD)谱，内源荧光，ANS结合荧光，以及胍变性和热变性等方法，研究了C末端序列缺失对TteRRF结构与功能方面的影响。实验结果表明：与TteRRF相比，虽然△C6TteRRF和△C9TteRRF在α-螺旋含量上分别减少了20％和27％，三级结构含量分别减少了10％和¨％；但是结合核糖体的能力以及在大肠杆菌细胞内解体翻译终止后复合物的活性仍接近于TteRRF。而△C12TteRRF和△C15TteRRF的结构完整性和稳定性则明显降低，其二级结构含量分别下降了39％和46％，三级结构含量分别下降了28％和45％；并且完全丧失了与核糖体的结合能力以及在大肠杆菌细胞内解体翻译终止后复合物的活性。由此我们认为：至少C末端前9个氨基酸残基的缺失对TteRRF的结构与功能影响不大，C末端尾巴可能不是TteRRF的活性调节元件(modulatorelement)，至少不具有普遍性。C末端前12个氨基酸残基的缺失使△C12TteRRF的构象发生显著变化，从而导致其失去与核糖体结合的能力。这些结果进一步验证了第二部分工作得出的有关domain工的结论，即domainⅠ主要负责与核糖体的结合；而且我们据此进一步推论，RRF与核糖体的有效结合是其发挥功能的必要前提。