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目前,脑血管疾病与心脏病、恶性肿瘤构成人类的三大致死病因,在我国为第二大致死病因;其以高发病率、高致残率和高死亡率而严重危害着人们的身体健康。临床上脑动脉粥样硬化、颅脑损伤、颅内血管性疾病等患者都可能发生脑组织缺血缺氧,尽早恢复脑组织的血供是治疗脑缺血缺氧的关键,但随着血供的恢复,往往会发生脑组织的缺血再灌注(ischemic-reperfusion I/R)损伤,影响患者的预后和神经功能恢复。大量的研究已表明进行脑缺血预处理能减少缺血再灌注损伤,但脑缺血的发生具有不可预知性,预处理临床应用有很大的局限。缺血后处理(ischemic postconditioning,IP)是指在组织缺血后、永久性再灌注前进行数次反复、短暂的再灌注/缺血处理或于再灌注前给予药物干预,调动机体内源性的保护机制以减轻组织再灌注损伤的处理措施,具有可控性,临床应用价值大。依达拉奉(Eda)作为一种自由基清除剂,其在脑缺血再灌注损伤的预处理中的保护作用已得到广泛的证实,而在组织水平上关于依达拉奉后处理对脑缺血再灌注损伤的作用及机制仍不清楚,值得我们进行研究。本研究分为两个部分: 第一部分:不同浓度依达拉奉后处理对乳鼠脑片过氧化氢损伤后凋亡的影响。 目的:观察不同浓度依达拉奉(Eda)后处理对乳鼠脑片过氧化氢(H202)损伤的保护作用。 方法:离体培养SD乳鼠大脑皮质脑片至第六天,将脑片随机分成对照组(Control组)、过氧化氢损伤组(H202组)、过氧化氢损伤+50μmol/L依达拉奉后处理组(Eda50组)、过氧化氢损伤+100μmol/L依达拉奉后处理组(Eda100组)、过氧化氢损伤+200μmol/L依达拉奉后处理组(Eda200组),共五组,每组12例。Control组予不完全培养基作用30 min后更换正常培养基继续培育24h,其余四组给予含有2mmol/L H2O2培养基作用30min后,H202组更换为正常培养基继续培养24h,Eda50、Eda100和Eda200组给予更换含对应浓度Eda的培养基继续培养24h,24h后,用HE染色观察脑片神经元形态学的改变及Nissl染色进行脑片存活神经元计数。 结果:⑴HE染色观察神经元形态学的改变:Control组神经元呈多边或梭形,胞膜完整,胞体饱满,细胞核清晰;H202组可见大量神经元细胞呈空泡状,胞核固缩,部分细胞卷曲、皱缩变形; Eda三组可见少量神经元细胞水肿、核固缩,细胞膜均较完整;⑵Nissl染色计数存活神经元:与Control组相比,H202组神经元数量明显减少(P<0.05);与H202组相比,Eda三组的神经元数量均明显增多(P<0.05),Eda组随Eda浓度的增加,神经元数量逐渐的增加(P<0.05)。 结论:依达拉奉后处理对乳鼠脑片过氧化氢损伤有剂量依赖性的保护作用。 第二部分:PI3K/Akt信号途径在依达拉奉后处理对乳鼠脑片过氧化氢损伤保护效应中的作用。 目的:探讨PI3K/Akt信号途径在依达拉奉后处理对乳鼠脑片过氧化氢损伤保护效应中的作用。 方法:离体培养SD乳鼠大脑皮质脑片至第六天,将脑片随机分成对照组(Control组)、过氧化氢损伤组(H202组)、PI3K特异性抑制剂LY294002+过氧化氢损伤组(LY组)、过氧化氢损伤+200μmol/L依达拉奉后处理组(Eda200组)、PI3K特异性抑制剂LY294002+过氧化氢损伤+200μmol/L依达拉奉后处理组(Eda200+LY组),共五组,每组12例。Control组予不完全培养基作用30 min后更换正常培养基继续培育24h,LY组和Eda200+LY组给以含有10μmol/L PI3K特异性抑制剂LY294002的培养基作用30 min后,除Control组外其余四组均给予含有2mmol/L H2O2培养基中作用30min,LY组和H202组更换为正常培养基继续培养24h,Eda200组和Eda200+LY组给予更换含有200μmol/L Eda的培养基继续培养24h。于培养24 h后,用HE染色观察乳鼠皮质脑片神经元形态学的改变;免疫组织化学法观察p-Akt蛋白的表达及分布;原位末端标记(TUNEL)法检测神经元的凋亡情况。 结果:⑴HE染色观察神经元形态学的改变:Control组神经元呈多边或梭形,胞膜完整,胞体饱满,细胞核清晰;H202组和LY组可见大量神经元细胞呈空泡状,胞核固缩,较多细胞卷曲、皱缩变形; Eda200组可见少量神经元细胞水肿、核固缩,细胞膜均较完整; Eda200+LY组脑片细胞层次不清,可见胞核消失,部分细胞卷曲、皱缩变形;⑵p-Akt蛋白的表达:与Control组相比,H202组p-Akt表达增多(P<0.05);与H202组相比,Eda200组p-Akt表达明显增多(P<0.05),LY组p-Akt表达减少(P<0.05);与Eda200组相比,Eda200+LY组p-Akt表达明显减少(P<0.05);⑶TUNEL法检测神经元的凋亡率:与Control组相比,H202组神经元的凋亡率明显增加(P<0.05);与H202组相比,Eda200组神经元的凋亡率减少(P<0.05),LY组神经元的凋亡率增加(P<0.05);与Eda200组相比,Eda200+LY组神经元的凋亡率明显增加(P<0.05)。 结论:依达拉奉后处理通过激活PI3K/Akt信号途径,促进Akt的活化,减少神经元的凋亡率,降低乳鼠脑片在过氧化氢中的损伤。