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油菜是我国重要的油料作物,通过基因工程来改良油菜农艺性状,对于油菜新品种培育具有重要意义。然而,传统的细胞核转基因技术产生的转基因油菜,其外源基因可通过花粉扩散至非转基因品种,以及其它近缘物种如白菜、芥菜,造成生态环境安全隐患。由于叶绿体基因为母性遗传,整合的外源基因不会随花粉扩散,因此叶绿体转化技术在油菜遗传改良中具有良好的发展应用前景。本研究在优化适于油菜叶绿体转化的愈伤诱导、分化再生体系的基础上,将外源基因转入油菜叶绿体中,首次经分子杂交证实,外源基因确已整合到油菜叶绿体基因组中且获得表达,并可遗传给下一代,为进一步筛选同质化转基因材料奠定了基础。主要研究结果如下：1.适于油菜叶绿体转化的组织培养体系研究。选用不同激素及其组合,设置了6种愈伤诱导培养基和3种分化培养基,分析比较表明,在含0.6 mg/L 2,4-D和0.2mg/L KT的愈伤诱导培养基上,良好愈伤状态维持时间长,愈伤组织淡绿致密、分化力强；而最佳分化培养基为1mg/L 6-BA、1 mg/L KT和0.5 mg/L NAA。尽管6-BA和NAA能够促进外植体迅速形成愈伤,但这些愈伤会很快进入分化阶段,伴随形成大量不定根,不适于叶绿体转化子筛选。2.筛选适于叶绿体转化的油菜基因型。选取48个油菜基因型,比较了它们的愈伤诱导和芽苗分化率,发现不同品种间分化率差异十分显著,分化率最高可达85.42%,而最低仅18.75%；其中FY-4、FY-15、FY-26、T13和T15这5个材料分化率高,适合叶绿体转化。3.油菜叶绿体转化载体的构建。通过生物信息学分析、克隆FY-4油菜叶绿体基因组中高度保守的DNA序列：trnI和trnA作为同源重组片段。pCL318-5和pCL1013-8中含有长度为1.5 kb的同源片段,pCL1031-F4中含有长度为2.5 kb的同源片段。外源基因HSA和筛选标记基因aadA以多顺反子形式构建在同一个表达框架下。启动子和终止子来源于烟草叶绿体,启动子为16S rRNA启动子Prrn,终止子为psbA基因的终止子TpsbA。基因的5’-UTR区域为T7噬菌体的T7g 10L5’-UTR,并在目的基因HSA的N-端融合绿色荧光蛋白GFP前14个氨基酸的核苷酸序列。4.以子叶为外植体的油菜叶绿体转化体系研究。以油菜品种FY-4子叶为外植体,使用pCL318-5载体进行基因枪转化。通过低筛选压(10～20 mg/L Spec)、长周期对子叶外植体进行筛选,共获得73株绿色抗性小苗,经PCR鉴定,19株绿色抗性苗中含有外源基因,PCR阳性率为26.02%,说明低筛选压情况下,非转基因逃逸频率较高。但低壮观霉素浓度对愈伤组织芽苗分化的抑制作用较小,因此具有较高的绿苗率(0.35%)。对来源于FY-4子叶外植体的PCR阳性苗进行Southern杂交分析,证明外源基因已插入到叶绿体基因组的特定位置。进一步对阳性苗的总RNA进行Northern杂交分析,证明外源基因以多顺反子形式获得表达,不同株系间外源基因的表达量存在明显差异。对收获的FY-4阳性植株的种子进行萌发鉴定和T1代植株叶片的PCR鉴定,证实外源基因整合并能够遗传给下一代。5.以叶片为外植体的油菜叶绿体转化体系研究。以油菜品种T15叶片为外植体,使用pCL1013-8载体进行基因枪转化。通过高筛选压(100～200 mg/L Spec)、长周期进行筛选,得到绿色抗性小苗7株,绿苗率仅为0.14%,经PCR鉴定,其中6株为阳性,PCR阳性率为85.71%。