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NGAL(Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin),一种25kD的糖蛋白,是lipocalin家族的新成员,具有典型的β折叠桶形空间结构特点。近年来有研究报道,NGAL蛋白可能拥有,1)保护调节基质金属蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9;即Gelatinase B)的活性;2)参与炎症与天然免疫反应;3)作为一种新型的铁离子转运载体,介导着一条新的独特的跨膜转铁通路等功能。2000年以来,我们课题组相继研究发现, NGAL在人食管上皮细胞癌变中异常过表达; NGAL异常过表达可促进食管癌细胞的侵袭移动; NGAL促进食管癌细胞侵袭移动主要由MMP-9等介导;下调NGAL表达可使食管癌细胞的微丝骨架和形态结构发生显著改变,促进癌细胞分化,与癌细胞的前体细胞/永生化食管上皮细胞的形态特征趋于一致。这些实验结果表明,NGAL可能是人类的一种十分重要的癌蛋白,与食管癌等肿瘤密切相关。然而在食管癌细胞中NGAL蛋白究竟是如何发挥作用的,尚有许多不明之处,具体包括如下三个方面:1哪种膜受体介导NGAL蛋白跨膜;2哪条通路参与NGAL蛋白的细胞内信号转导传递;3最终又有哪些基因应答NGAL蛋白的作用,发生表达变化;等等。为此,在本文中,我们着重探讨了NGAL蛋白在体外对食管癌细胞的诱导作用,发现体外直接加入的NGAL蛋白与细胞内表达的NGAL蛋白,对食管癌细胞所产生的生物学效应明显不一样,前者诱导食管癌细胞发生一种特殊形式的自噬,但不是凋亡,而后者会进一步增进食管癌细胞的侵袭转移能力,同时促进实验动物发生恶病质。有关体外直接加入NGAL蛋白诱导食管癌细胞发生自噬的实验结果详见下述。首先,在酵母细胞中重组表达NGAL蛋白,柱层析分离纯化,得到NGAL蛋白纯品溶液。其次,筛选NGALR(NGAL Receptor)高表达与弱表达的人食管癌细胞系,EC1.71和EC109,作为对比实验细胞模型。再次,将不同浓度的NGAL蛋白分别加入到EC1.71和EC109食管癌细胞培养上清中作用不同时间。最后,通过综合运用荧光显微镜观察、相差显微镜观察、免疫印迹、RT-PCR和ferrozine染色等多种实验技术手段,结合生物信息学分析,研究了NGAL蛋白对食管癌细胞的体外诱导作用。具体实验结果包括如下八个方面:1)EC1.71和EC109皆可以内吞NGAL蛋白到细胞内,但相比较而言,EC1.71内吞NGAL蛋白的能力明显强。2)随着加入NGAL蛋白的浓度逐渐增高,特别是达到50μg/ml时,两种食管癌细胞EC1.71和EC109的形态均发生明显改变,主要特征是细胞收缩变小,形态变圆,同时细胞数目也减少,细胞的贴壁能力下降;而两种食管癌细胞EC1.71和EC109相比,应对NGAL蛋白的诱导作用,EC1.71似乎更敏感一些,形态变化更显著,细胞收缩更明显。3)单丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverine,MDC)标记,绿色荧光检测结果表明,与对照组相比,随着NGAL蛋白浓度逐渐由低到高,特别是当浓度升高达到5-50μg/ml时,两种食管癌细胞EC1.71和EC109的绿色荧光显色均显著变强,表明有明显的细胞自噬发生。但两种食管癌细胞EC1.71和EC109相比,在NGAL蛋白浓度相同条件下,似乎前者的绿色荧光显色更强一些。这可能同样与两种细胞的NGALR表达,以及其它相关分子的差异性本质有关。4)在pLC3-GFP融合质粒预先转染的基础上,检测LC3的异位分布变化情况,结果发现,在50μg/ml的NGAL蛋白作用后,无论是EC1.71,还是EC109,两种食管癌细胞均发生了明显的LC3易位分布变化,显现典型的膜性易位聚集特征,表明细胞确实发生了自噬。5)有关NGAL蛋白对食管癌细胞内铁离子与铁蛋白水平影响的检测结果表明,在本文的细胞模型实验条件下,外源性NGAL蛋白的作用并未引起细胞内的铁离子浓度明显改变,而细胞内铁蛋白的表达水平也未受到明显影响。6)有关NGAL蛋白激活食管癌细胞ERK细胞信号转导通路的检测结果表明,50μg/ml的NGAL蛋白仅分别作用5min,两种食管癌细胞均出现了p-ERK1/2水平的明显升高,而且在接续下来的30min-24h时间范围内一直保持着这种水平,而在此之前,至少NGAL蛋白作用6h,模型细胞尚未发生明显的自噬现象。这表明ERK1/2激活是细胞自噬前的生物化学反应事件,可能是NGAL蛋白诱导食管癌细胞发生自噬的分子机制关键环节所在。7)有关NGAL蛋白激活食管癌细胞p38和JNK细胞信号转导通路的检测结果表明,在NGAL蛋白作用下,细胞中p38和JNK等MAPK的活性有一定的变化,但不如ERK明显。8)有关自噬相关基因atg5、beclin1和DAPK等的转录情况的检测结果表明,NGAL蛋白的作用能够使EC1.71和EC109,在前期激活ERK1/2之后,进一步导致atg5、beclin1和DAPK等自噬相关基因转录增强。综合以上实验结果可见,诱导细胞发生自噬是外源性NGAL蛋白经由内吞途径进入食管癌细胞发挥作用的机制之一,与NGAL蛋白跨膜转铁未见直接关联,而ERK信号转导途径可能参与了这一过程。