肝脏是机体最大的实质性脏器,参与机体的代谢、解毒、免疫及凝血等生理过程,在维持机体的健康中发挥着至关重要的作用。然而,环境污染、药物滥用、生活压力大及酗酒等不利因素持续增加,肝脏损伤相关疾病的发病率不断上升,严重威胁了人们的正常生活。临床上常用的保肝药物,多为化学合成类药物,其多具有研制周期长、成本高的缺点,且常伴随有不良反应和耐药性等问题,应用范围受到了较大的限制。近年来研究发现,药食同源的天然植物药在肝损伤的治疗中,呈现出安全低毒、经济实惠、治疗多样化的独特优势,日益受到关注。本课题将从食源性天然产物Xm中探寻具有保肝效应的活性成分,并对其作用机制展开初步研究。第一章综述本章对肝脏损伤及其致病因素进行了概述,重点归纳了肝损伤的发生机制,阐述了近年来食源性活性成分治疗肝损伤的研究进展,并对肝损伤研究方法的新进展进行了展望。近年来,随着全球“回归自然”浪潮的兴起和发展,从食源性天然产物中开发具有保肝作用的活性成分已成为抗肝损伤研究的新趋势。第二章食源性保肝活性成分的筛选及鉴定本章节采用药效追踪法,将Xm水提物先后经二氯甲烷、乙酸乙酯和水饱和正丁醇溶液进行萃取,采用CCl₄诱导的肝损伤模型考察各萃取部位的保肝作用,结果显示正丁醇部位可以使肝损伤小鼠血清中转氨酶水平显著降低,具有良好的肝脏保护作用。采用色谱分离法,将正丁醇活性部位依次通过硅胶层析柱和ODS柱分离纯化,并进行HPLC-DAD分析,最终收集得到主成分化合物Compound1。采用MS和NMR对Compound 1进行结构解析,确定该化合物为1-[O-（4-羟基甲基苯基）]-α-L-吡喃鼠李糖苷（天麻苷元-鼠李糖苷,GR）。药效学实验证明GR为Xm中保肝活性成分。第三章GR的急性毒性实验研究本章采用固定剂量法（FDP）考察其经口急性毒性,一次性给与不同剂量的GR（50,500,1000,2000 mg/kg）后,持续观察14 d。期间小鼠均未出现死亡情况,且所有小鼠毛色光洁、活动力强、饮食正常、无稀便和腹泻症状。且GR处理组雌性和雄性小鼠的体重和脏器系数与正常组小鼠相比均未发生统计学差异（p>0.05）。此外,HE染色发现,GR对心、肝、脾、肺、肾、脑均未造成病理性损伤。由此说明GR对小鼠的行为反应、体重变化和组织形态均不产生影响。GR处理组在2000 mg/kg的剂量下未出现明显的器官改变和死亡现象,说明GR的致死剂量(LD₅₀)高于2000 mg/kg,按照全球化学品统一分类和标签制度（GHS）规定,GR为5类化学物质,为无毒物质,具有较高的安全性。第四章GR体内分析方法的建立与验证本章节建立了GR的UPLC-MS/MS体内分析方法,并对其进行了方法学验证。方法选用Shim-pack XR-ODSⅢC18（2.0 mm×75 mm,1.6μm）色谱柱进行分离;流动相为乙腈:0.1%甲酸溶液（12:82,v/v）;柱温40°C;流速0.2 mL/min;进样体积2μL;测定波长222 nm;运行时间5 min。采用负离子-多反应监测（MRM）模式对离子对进行检测,GR和内标（酪醇）的离子对变化结果为:GR为m/z[M+HCOO]^-314.9→[M-H]^-269.0,碰撞能CE为17 eV;内标为[M+HCOO]^-182.85→[M-H]^-137.0,碰撞能CE为25 eV。结果表明,GR在生物样品中的线性范围为10-2500 ng/mL（r≥0.999）,定量下限（LLOQ）为10 ng/mL;日内及日间的精密度均在5%以内,准确度为-11.4%至8.33%;萃取回收率和基质效应分别为80.32¹01.31%和90.36¹03.76%;GR生物样品在室温和-20℃分别放置24 h和15 d后均未发生明显的浓度变化,稳定性良好。说明该方法符合方法学要求,可应用于GR和内标的定性定量分析。第五章GR的体内药动学和组织分布研究本章节应用所建立的UPLC-MS/MS方法,对GR口服和尾静脉给药后的体内药动学及组织分布进行了研究。药动学结果显示:口服（i.g.）和尾静脉（i.v.）给药组的GR血浆浓度在3 h内从C_max（558.14±86.91 ng/mL和2329.47±659.70ng/mL）迅速下降,3 h后未能检测到。此外,口服和尾静脉给药组的半衰期(t_1/2)分别为32.76±5.39（i.g.）min和27.98±5.81（i.v.）min,平均滞留时间（MRT）分别为46.35±4.97（i.g.）min和24.84±4.78（i.v.）min,这表明GR在体内滞留时间较短,可迅速地从血液循环系统中被清除。组织分布研究发现:口服和尾静脉给药后,GR在短时间内迅速地分布于各个脏器中,且主要分布于心、脾、肾等血流量丰富的器官中,表明器官血流量和灌注速率可能影响GR的体内分布。同时,在脑中也能检测到GR的分布,说明该化合物具有穿越血脑屏障的能力。此外,GR在肝脏中有持续稳定的分布,表明其可能具有一定的体内保肝潜力,值得进一步研究。但是GR在大多数组织中的滞留时间均较短,尤其是尾静脉给药后,药物含量在30 min内下降将近90%,表明其在体内可被迅速清除。第六章GR的体内保肝药效评价及其机制研究本章采用腹腔注射0.2%CCl₄的方式诱导小鼠急性肝损伤模型,对GR的保肝药效进行评价,并从抗氧化应激和抗炎途径探究GR的保肝作用机制。结果发现,与模型组相比,GR可明显缓解由CCl₄引起的肝脏异常肥大及增长,还可显著降低小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（AKP）的水平(^#p<0.05,^##p<0.01,^###p<0.001),其恢复水平接近水飞蓟宾组。同时,GR组小鼠肝脏中酶类抗氧化指标（超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和过氧化氢酶（CAT））和非酶抗氧化指标（谷胱甘肽谷胱（GSH）和总抗氧化能力（T-AOC））的水平显著上升,脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量显著下降(^#p<0.05,^##p<0.01,^###p<0.001),且均呈现出剂量相关性,说明GR可有效地抑制CCl₄诱导的氧化性肝损伤。此外,炎症因子检测表明,GR治疗组可显著降低致炎细胞因子(肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-1（IL-1β）和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的水平,调节抗炎细胞因子白介素-10（IL-10）的水平,进而抑制CCl₄诱导的炎性肝损伤。小鼠肝脏组织病理学结果显示,GR不同剂量组小鼠的肝脏损伤程度得到明显改善,可见中央小静脉结构,炎症细胞浸润减少,肝细胞未出现明显的变性、肿胀和坏死等现象,表明GR可有效修复CCl₄诱导产生的肝损伤。