研究背景外伤或病理性骨吸收导致的骨缺损已成为当前全球关注的健康问题之一,骨缺损的修复再生也引起了再生医学、组织工程及生物材料领域的广泛关注。目前骨假体移植修复作为骨缺损治疗重要手段之一,能够较好的对缺损部位进行填充与替代。然而植入体内的骨移植材料由于应力等因素引起的界面溶解或无菌松动产生假体磨屑十分常见。植入物的磨屑成分可影响假体周围组织与邻近细胞的生物活性[到,从而诱发系列的炎症级联反应,启动和加速骨溶解的过程,最终导致骨移植失败；同时假体磨屑颗粒还可对新生骨的生成造成不利影响,如金属钛颗粒能够下调Ⅰ型胶原的表达,高分子量聚乙烯(UHMWPE)颗粒影响成骨细胞的分化进程,UHMWPE颗粒同时具有细胞毒性,干扰成骨细胞纤连蛋白表达并降低其粘附性能。在生物材料领域中,具有生物活性功能的钙磷陶瓷粉体,如羟基磷灰石(HAp),常作为骨缺损填充或移植基质材料广泛应用于临床。但由于羟基磷灰石脆性较大,假体磨屑易于出现。目前体外研究表明,类似磨屑的羟基磷灰石颗粒,其颗粒大小及表面化学特征对诱发细胞炎症反应具有重要影响；也可直接影响细胞内吞效率；或进一步影响细胞活性、粘附与增殖等生物学特性,但目前有关HAp形貌与特定细胞生物特性的相关性研究尚不多见。Motskin M进一步指出不同合成工艺制备的HAp对细胞毒性与细胞内环境稳定性的影响具有差异,这表明制备工艺的差异也可引起接触性细胞功能的差异。基于以上研究背景,在共培养环境下,我们推测不同形貌HAp可能对体外细胞的生物学行为有不同的影响效应。为此,我们采用水热合成技术,通过调节pH值制备微棒与微球两种羟基磷灰石微粒,确保其合成工艺和化学成分的均一性。由于体内环境下骨-移植材料界面主要表现为成骨与破骨发生的动态平衡,我们分别培养了小鼠骨髓源间充质干细胞(mBMSC)和小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7),分别进行体外成骨、破骨分化诱导,探讨不同形貌的HAp对培养细胞的活性、增殖、凋亡、成骨及破骨分化效应的影响。主要研究内容第一章不同形貌羟基磷灰石微粒的合成与表征[目的]采用水热合成及pH值调控技术制备不同形貌、具备良好均一性的羟基磷灰石微粒。[方法]将12mM磷酸氢二铵加入60m1去离子水中,用硝酸分别调pH至6.0和5.0后,加入20mM四水硝酸钙,将pH调至5.0。搅拌混匀加入0.9g柠檬酸钠,溶液转移至聚四氟乙烯瓶中,180℃反应2h后自然冷却。去离子水洗反应后沉淀,离心冷冻干燥。冻干后将两种形貌羟基磷灰石样品放于真空镀膜机内,样品表面喷金后于扫描电镜(SEM)下进行扫描观察；分别采用X-射线衍射(XRD)与傅立叶变换红外分析(FTIR)检测两种HAp微粒的晶相与化学组成。[结果]扫描电镜结果显示,两种(微棒与微球)羟基磷灰石微粒粒径限于1-3μm,同种颗粒形貌一致。XRD晶相分析与FTIR光谱分析证实合成的两种HAp颗粒具备在晶相与化学成分的一致性。[结论]采用水热合成技术,以柠檬酸盐成分可合成羟基磷灰石微粒；通过调控pH范围,可获取微棒与微球羟基磷灰石微粒,且微粒形貌均一性良好。第二章不同形貌羟基磷灰石微粒对体外mBMSC细胞生物学行为的影响[目的]为探讨不同形貌HAp微粒对体外共培养细胞成骨分化特性的影响,本实验采用小鼠骨髓源间充质干细胞mBMSC与两种形貌的羟基磷灰石微粒体外共培养,检测共培养条件下mBMSC毒性或活性、凋亡与增殖、成骨分化等生物学性能,对比分析微棒与微球微粒对mBMSC细胞生物学特性影响是否存在差异。[方法]mBMSC细胞按1×104/cm2密度接种于24孔板中,贴壁培养过夜。以不同材料终浓度200μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml处理细胞24h,检测细胞LDH分泌量来定量分析不同浓度下不同形貌HAp微粒的细胞毒性,同时采用Calcein AM活性染色观察HAp颗粒对细胞活性影响情况；ARS染色检测分析材料处理24h后细胞-材料的相互关系；采用Hoechst33258进行细胞凋亡染色,Western Blot检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Caspase-3)的表达；CCK-8检测共培养细胞1d、3d、5d增殖情况；采用成骨诱导液诱导nBMSC成骨分化,分别进行碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定成骨分化水平和荧光定量PCR检测成骨相关基因(ALP、OC、ColI、 Runx2)的表达水平。统计分析采用SPSS13.0统计软件完成,结果用均值±标准差(x±s)来表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐性的组间比较采用Tukey法,方差不齐的组间比较采用Dunnett’s T3法,P<0.05认为差异有统计学意义。[结果]乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性分析显示,共培养24h时,微棒与微球颗粒均干扰mBMSC的细胞活性。较之微球颗粒,微棒对细胞活性的影响更为显著(P<0.01),并呈现浓度依赖性。Calcein AM活性染色进一步证实微棒与微球HAp的细胞毒性。茜素红染色(ARS)检测证实,微球与微棒HAp与细胞的相容性存在差异。24h时,微棒颗粒处理组染色强度高于微球组(P<0.05),染色颗粒多随细胞的延展而分布,而微球组的染色颗粒多围绕细胞胞体。结果表明,相对于微球HAp,微棒HAp可能更有利于mBMSC细胞内吞或与其发生接触。凋亡染色与凋亡蛋白检测表明,微棒与微球颗粒均抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,同时上调凋亡通路下游蛋白Caspase-3蛋白水平,表明在共培养环境中两种微粒促进mBMSC细胞凋亡,且微棒微粒的促凋亡效应更为明显。我们延长细胞与材料的共培养时间,并检测两种材料对细胞增殖的影响。CCK-8分析证实,培养5d时,对照组mBMSC细胞增殖良好,但两种HAp处理组的细胞增殖能力均低于对照组(P<0.01)；较之微球HAp,微棒HAp对细胞增殖抑制更为显著(P<0.01)。为进一步探讨不同形貌mHAp对mBMSC细胞成骨分化的影响,我们对采用材料处理同时进行成骨诱导,诱导14d mBMSC碱性磷酸酶(ALP)染色结果显示,单纯诱导组细胞阳性染色明显高于微棒与微球处理组(P<0.01)；微球组染色强度高于微棒组(P<0.01)。qRT-PCR分析细胞内的成骨相关基因,结果表明,较之单纯诱导组,微棒与微球组中ALP、OC、Coll、Runx2基因的表达显著下调(P<0.01),以微棒组的表达抑制更为明显(P<0.01)。[结论]共培养条件下,不同形貌的HAp微粒对体外培养mBMSC细胞生物学特性影响存在差异。两种形貌HAp均不利于共培养细胞的活性和功能分化。较之微球颗粒,微棒HAp与mBMSC细胞的接触更为紧密,呈现更为显著的细胞毒性和促凋亡效应、增殖抑制、成骨分化抑制效应。第三章不同形貌羟基磷灰石微粒对体外RAW264.7细胞生物学行为的影响[目的]为探讨不同形貌HAp微粒体外条件下是否干扰共培养细胞的破骨分化功能,本实验采用小鼠类单核巨噬细胞RAW264.7与两种形貌HAp微粒体外共培养,分别检测共培养条件下RAW264.7细胞毒性或活性、凋亡与增殖、破骨分化等生物学性能,对比分析微棒与微球微粒对RAW264.7细胞生物学特性影响是否存在差异。[方法]RAW264.7细胞按1×104/cm2密度接种于24孔板中,贴壁培养过夜。以不同材料终浓度200μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml处理细胞24h,检测细胞LDH分泌量来定量分析不同浓度下不同形貌mHAp微粒的细胞毒性,同时采用CalceinAM活性染色观察细胞活性情况；ARS染色检测分析材料处理24h后细胞-材料的相互关系；采用Hoechst33258进行细胞凋亡染色,Western Blot检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Caspase-3)的表达；CCK-8检测共培养细胞1d、3d、5d增殖情况；采用RANKL诱导RAW264.7细胞破骨分化,分别进行抗酒石酸(TRAP)染色鉴定破骨分化水平和荧光定量PCR检测破骨表型基因(RANK、TRAP、MMP-9、CTSK)及破骨通路相关基因(IκB α、IKK β、c-Fos、NFATc1)的表达水平。统计分析采用SPSS13.0统计软件完成,结果用均值±标准差(x±s)来表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐性的组间比较采用Tukey法,方差不齐的组间比较采用Dunnett’s T3法,P<0.05认为差异有统计学意义。[结果]乳酸脱氢酶(LDH)分析表明,共培养24h时,RAW264.7细胞活性与对照组比较并无差异。同时Calcein AM活性染色进一步证实两种微粒不影响RAW264.7细胞活性。茜素红染色检测证实,微球与微棒HAp与细胞的相容性存在差异：24h时,微棒颗粒组的染色强度高于微球组(P<0.05),染色分布弥散,且细胞内可见染色颗粒分布；微球组的染色则多集中于细胞胞体周围。与我们之前检测一致,微棒HAp可能更有利于RAW264.7细胞内吞或与其发生接触。较之单独培养的RAW264.7细胞,微棒与微球颗粒均诱导显著的细胞凋亡。mHAp处理组细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调,而凋亡通路蛋白Caspase-3的表达上调。统计分析结果表明微棒颗粒的促凋亡效应更为明显。延长细胞与HAp微粒共培养时间至5d,并采用CCK-8分析细胞的增殖效应,我们发现,对照组细胞增殖良好,而mHAp处理组的细胞增殖能力显著降低(P<0.01)；较之微球HAp,微棒HAp对细胞增殖的抑制作用更为显著(P<0.01)。为进一步探讨不同形貌mHAp对RAW264.7细胞破骨分化的影响,我们选用了抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色的方法。结果表明,破骨分化诱导组的TRAP阳性细胞数量显著高于对照组(未诱导组)(P<0.01)；但我们未发现微棒与微球HAp共培养的细胞(破骨诱导)存在TRAP阳性表达细胞数量及表达量的差异。qRT-PCR检测证实,RANKL诱导可引起RAW264.7细胞内相关的破骨表型基因RANK、TRAP、MMP-9、CTSK的高表达(P<0.01)。较之RANKL诱导组(单纯诱导组),微棒与微球颗粒处理明显下调上述基因以及NF-kB通路关键因子的表达水平。[结论]共培养条件下,两种形貌HAp微粒均不利于共培养RAW264.7细胞的活性和功能分化：与HAp微粒的接触可加速细胞凋亡、抑制增殖、抑制破骨分化。较之微球颗粒,RAW264.7细胞对微棒HAp的干扰作用更为显著。