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目的:维甲酸相关孤核受体α(Retinoid acid receptor related Orphan Receptorα,RORα)可能参与多种肿瘤的调控。二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)可诱导人胃癌细胞增殖抑制、分化与细胞周期G2/M期阻滞,其机制可能与RORα蛋白表达上调有关,但其具体机制不明,因此本研究通过microRNA干扰技术将RORα基因沉默,观察其对DADS诱导的增殖抑制与周期阻滞的影响,探讨DADS抑制人胃癌细胞作用的分子机制。方法:1.根据GenBank提供的RORα基因序列设计4条RNA干扰序列,命名为miRNA1、miRNA2、miRNA3、miRNA4,并设计1条非特异性序列作为阴性对照。合成各自的寡核苷酸链,退火后与miRNA表达载体pcDNATM6.2- GW/EmGFPmiR连接,转化扩增后测序,将含靶向RORα的miRNA的质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFpmiR-RORα转染SGC7901, MGC803细胞,建立稳转细胞系,通过Western blot验证miRNA-RORα对RORα表达的抑制作用;2.细胞计数、MTT法和流式细胞术分析RORα表达下调对DADS诱导胃癌细胞增殖与周期的影响。结果:1.重组pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-RORα-miRNA质粒经单酶切与DNA测序分析证明重组载体构建成功,荧光显微镜下观察可见转染细胞内的绿色荧光。Western blot结果显示,与未转染组相比,转染RORα-miRNA后使人胃癌SGC7901、MGC803细胞内RORα蛋白表达均明显降低(P<0.05)。2.细胞计数结果显示,与未转染组比较,RORα-miRNA转染组细胞增殖率增加,且群体倍增时间缩短(P<0.05),说明抑制RORα基因表达促进了SGC7901、MGC803细胞增殖。而阴性转染组增殖率、群体倍增时间无明显改变(P>0.05)。DADS处理后,各组细胞群体倍增时间均延长,细胞增殖被抑制,但miRNA干扰RORα表达后的两组细胞经DADS处理后,其细胞群体倍增时间延长幅度明显低于DADS处理的未转染组(P<0.05),说明抑制RORα表达削弱了DADS诱导的增殖抑制作用。3. MTT结果显示,RORα-miRNA转染可使SGC7901、MGC803细胞的增殖率(光吸收值)明显高于未转染组(P<0.05),说明干扰RORα表达可促进细胞增殖。而阴性转染组增殖率无明显改变(P>0.05)。分别加入15mg·L-1、30mg·L-1 DADS 24h后,RORα-miRNA3转染的SGC7901、MGC803细胞的增殖抑制率分别为27.14%、33.48%,均明显低于DADS处理的未转染组36.15%、45.35% (P<0.05),48h、72h和96h后也是一样的结果,提示干扰RORα表达削弱了DADS的抑制增殖作用。4.流式细胞术发现,与未转染组比较,转染RORα-miR3后SGC7901、MGC803细胞周期中G0/G1期细胞百分比明显降低,而S期和G2/M期细胞百分比增高(P<0.05),且增殖指数也增高(P<0.05),说明干扰RORα表达后有促进细胞增殖作用,而阴性转染组各期百分比、增殖指数无明显改变(P>0.05)。15mg·L-1、30mg·L-1 DADS分别处理RORα-miR3转染组SGC7901、MGC803细胞24h后,G2/M期百分率均明显低于DADS处理的未转染组(P<0.05),表明干扰RORα表达可削弱DADS对SGC7901、MGC803细胞的G2/M期阻滞作用。结论:1. miR-RORα表达载体(pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-RORα)转染细胞后可明显抑制人胃癌SGC7901、MGC803细胞中RORα表达。2. microRNA抑制RORα表达后,可促进人胃癌SGC7901、MGC803细胞增殖,并且削弱DADS的增殖抑制及G2/M期阻滞作用,说明RORα表达上调可能是DADS抑制人胃癌细胞作用的分子机制之一。