目的免疫学检测方法的准确性主要取决于诊断抗原的性质,目前用于日本血吸虫病血清免疫学诊断的抗原主要为日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)成虫或虫卵的粗抗原,由于抗原组分复杂,与临床常见寄生蠕虫间交叉反应多,严重影响诊断的准确性[1-8]。为了解决这一交叉反应难题,不少学者主要致力于寻找敏感性和特异性兼备的诊断抗原分子,而对交叉反应的机理研究相对甚少。1995年Wisnewski[9]报道:陆生蚯蚓(Lumbricus terrestris,Lt)抗原能与血吸虫病患者血清结合,而不与正常人血清反应;竞争性ELISA抑制水平可达30%以上;用Lt抗原免疫感染血吸虫的小鼠可获得36%减虫率,产生的抗体能与多种血吸虫成虫抗原结合。这一研究结果,为寻找常见寄生蠕虫间交叉反应的同源性抗原分子提供了一条新思路。本课题组多年来在对蚯蚓与血吸虫、肺吸虫、囊虫和旋毛虫等常见寄生蠕虫间交叉反应现象的研究[10-13]中发现:蚯蚓抗原能降低血吸虫病、肺吸虫病、囊虫病、旋毛虫病等蠕虫病患者血清抗体相互之间的交叉反应率;目前还没有某种蠕虫抗原能象蚯蚓抗原一样,同时识别血吸虫病、肺吸虫病、旋毛虫病和囊虫病患者血清,而不与正常人血清发生反应。鉴此,蚯蚓作为一种特殊抗原在血吸虫病诊断研究中有着潜在的应用价值。本实验采用噬菌体展示技术(phage display technique, PDT)筛选获得蚯蚓与日本血吸虫的共同模拟表位;通过饱和硫酸铵溶液梯度盐析法提取蚯蚓可溶性蛋白;利用SDS-PAGE和Western-blot技术,对蚯蚓与日本血吸虫共同模拟表位、蚯蚓的梯度盐析蛋白、蚓激酶(lumbrukinase)和应激蛋白(Stress proteins , SP)等分子成分及交叉反应性进行分析,探讨蚯蚓与日本血吸虫间交叉反应的重要分子基础,为研究和解决临床常见蠕虫病血清免疫学诊断中交叉反应现象提供理论和实验依据。方法1.蚯蚓与日本血吸虫共同模拟表位的筛选及交叉反应性分析(1)蚯蚓与日本血吸虫共同模拟表位的筛选依次以日本血吸虫病患者血清(Sj-Ig)、蚯蚓免疫兔血清(Lt-Ig)和Lt-Ig、Sj-Ig作为靶分子,以噬菌体12肽库的第三轮扩增肽库为源肽库,进行2轮吸附-洗脱-扩增的免疫筛选,每轮随机挑取蓝色噬斑各21个,ELISA方法检测其抗原性,并对其反应性较好的阳性克隆进行测序。(2)共同模拟表位交叉反应性的分析采用SDS-PAGE和Western-blot方法,制备12%分离胶和6%浓缩胶,对经筛选所获的蚯蚓与日本血吸虫共同模拟表位进行SDS-PAGE电泳,分析蛋白组分。电泳分离后转至NC膜,并与日本血吸虫病患者血清反应,分析蛋白组分的交叉反应性。2.蚯蚓梯度盐析蛋白的制备及交叉反应性分析(1)蚯蚓梯度盐析蛋白的制备参考饱和硫酸铵溶液盐析提取蚯蚓蚓激酶的方法[14-17],依次用30%、40%、50%、60%、70%饱和硫酸铵溶液梯度盐析,沉淀蚯蚓可溶性蛋白。(2)盐析蛋白交叉反应性的分析采用SDS-PAGE和Western-blot,制备12%分离胶和6%浓缩胶,对蚯蚓的盐析蛋白进行SDS-PAGE电泳,分析蛋白组分。电泳分离后转至NC膜,并与日本血吸虫病患者血清反应,分析蛋白组分的交叉反应性。3.蚯蚓蚓激酶交叉反应性的分析采用SDS-PAGE和Western-blot,具体操作同蚯蚓梯度盐析蛋白交叉反应性的分析。4.蚯蚓应激蛋白的制备及交叉反应性分析(1)蚯蚓应激蛋白的制备参考加热刺激产生应激蛋白的相关文献[18-21],取蚯蚓10条,40℃加热30 min,收集蚯蚓分泌物,即蚯蚓应激蛋白。(2)应激蛋白交叉反应性的分析采用SDS-PAGE和Western-blot,具体操作同蚯蚓梯度盐析蛋白交叉反应性的分析。结果1.蚯蚓与日本血吸虫共同模拟表位的筛选及交叉反应性分析(1)共同模拟表位的筛选经过2轮的吸附-洗脱-扩增,获得了6个A491nm值较高的克隆(Lt9、Lt14、Sj17、Sj18、SjLt6、SjLt11),通过DNA测序,经BLAST软件分析,发现:Lt9与血吸虫的抱雌沟蛋白和蚯蚓的NADH脱氢酶亚单位1有4个连续的氨基酸(LAET)一致;Sj17与血吸虫的1-α延长因子和蚯蚓的1-α延长因子有4个不连续氨基酸(HT-HI)一致;SjLt11与血吸虫的乳酸脱氢酶样蛋白和蚯蚓的NADH脱氢酶亚单位6有4个连续的氨基酸(NSIL)一致。(2) 3个共同模拟表位交叉反应性的分析将Lt9、Sj17、SjLt11这3个共同模拟表位同日本血吸虫病患者血清反应,得到分子量为64.9 kDa的交叉反应带。2.蚯蚓梯度盐析蛋白的SDS-PAGE和Western-blot结果30%～70%饱和(NH4)2SO4溶液能沉淀较多的蚯蚓可溶性蛋白,对应的分子量在25.3～112.7kDa和<18.3kDa范围内,其中主带分子量在25.3～54.7kDa和<18.3kDa;与日本血吸虫病患者血清反应,对应显色带的分子量在20.4～110.2kDa,其中主带分子量为34.7、37.1～45.2、59.2、76.7～81.9、88.4～96.6 kDa。3.蚯蚓蚓激酶的SDS-PAGE和Western-blot结果在SDS-PAGE胶上存在分子量为26.7～97.8 kDa的蛋白带,与日本血吸虫病患者血清反应,对应显色带的分子量在39.8～95.1 kDa。4.蚯蚓应激蛋白的SDS-PAGE和Western-blot结果在SDS-PAGE胶上存在分子量为28.3～97.8kDa和<19.6 kDa的蛋白带,与日本血吸虫病患者血清反应,对应显色带的分子量在61.2～95.1 kDa。结论1.用日本血吸虫病患者血清和蚯蚓免疫兔血清筛选噬菌体12肽库可获得3个蚯蚓与日本血吸虫共同模拟表位。2.饱和硫酸铵溶液梯度盐析法能有效地从蚯蚓可溶性物质中提取到与日本血吸虫间交叉反应的蛋白抗原组分,对应的分子量在20.4～110.2kDa。3.蚓激酶与日本血吸虫间存在交叉反应抗原,对应的分子量在39.8～95.1 kDa。4.蚯蚓应激蛋白与日本血吸虫间也存在交叉反应抗原,对应的分子量在61.2～95.1 kDa。综上所述,蚯蚓与日本血吸虫共同模拟表位、蚯蚓的盐析蛋白、蚓激酶和应激蛋白与日本血吸虫病患者血清间均存在分子量为61.2～95.1 kDa的免疫交叉反应带,表明:蚯蚓与日本血吸虫间存在分子量为61.2～95.1 kDa的共同蛋白组分,该组分中可能部分属于酶类,氨基酸序列可能包含NSIL、LAET和HT-HI片段,该类物质是蚯蚓与日本血吸虫免疫交叉反应的重要分子基础。由此可见,蚯蚓与日本血吸虫间免疫交叉反应的分子基础可能部分属于酶类,蚯蚓可溶性蛋白作为一种特殊抗原在寄生虫病诊断研究中有着广阔的应用前景。