抗CD47纳米抗体的制备和鉴定

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CD47是一种广泛表达的膜蛋白,也称为整合素相关蛋白(IAP)。作为巨噬细胞和髓样细胞表面的信号调节蛋白α(Signal regulatory protein alpha,SIRPα)的配体,其与SIRPα的相互作用,对吞噬细胞提供了负调控信号,抑制了巨噬细胞的吞噬作用。近年来,发现CD47在白血病、淋巴瘤和几乎所有实体瘤中均高表达,CD47-SIRPα信号的激活抑制了吞噬细胞对肿瘤的清除作用,成为肿瘤逃逸免疫监视的机制之一。采用抗体或拮抗剂阻断CD47-SIRPα信号通路,从而恢复免疫细胞功能,成为抗肿瘤免疫治疗的新策略。食管癌是新疆地区高发癌症之一,其对常规化疗具有耐药性并且预后不良,需要发展新的治疗策略。目前,还没有研究报道食管癌细胞是否表达CD47,也没有靶向CD47治疗食管癌的报道。纳米抗体是骆驼中天然缺失轻链的重链抗体的可变区片段,是目前最小的具有完全抗原结合功能的单域抗体。因其具有分子小、组织穿透能力强、易于结合蛋白裂隙表位和生产成本低等优点,已经成为开发新一代治疗抗体很有希望的候选分子。本研究的目的主要有两方面,一是通过CD47单抗对食管癌的作用,初步评价CD47作为抗食管癌细胞作用靶点的价值;另一方面是建立双峰驼天然VHH噬菌体文库,通过噬菌体展示技术,筛选和获得抗CD47纳米抗体,为今后开展纳米抗体抗肿瘤作用研究提供基础。本研究主要包括以下两部分内容:1.抗CD47单克隆抗体对体外食管癌细胞的抗肿瘤作用研究首先采用RT-PCR、流式细胞术、Western-Blot和细胞免疫荧光等检测食管癌细胞表面CD47的表达。其次,采用小鼠巨噬细胞体外吞噬实验检测抗CD47单克隆抗体(B6H12)对食管癌的抗肿瘤作用。采用CFSE对食管癌细胞进行荧光标记。食管癌细胞增殖和凋亡分别采用CCK-8和Annexin V-FITC用流式细胞仪检测。结果表明,所有检测的食管癌细胞与Vero细胞相比CD47表达差异显著;其中ec9706和kyse150细胞cd47的表达显著高于eca-109细胞。对ec9706和kyse150进行的细胞增殖和吞噬实验结果显示,抗cd47单抗(b6h12)处理后的细胞系,细胞增殖受到明显的影响,与igg1同种型抗体相比,差异显著(p<0.05)。将小鼠巨噬细胞与cfse标记的ec9706和kyse150细胞共孵育,抗cd47单抗(b6h12)与igg1同种型抗体相比,小鼠巨噬细胞对食管癌细胞ec9706和kyse150的吞噬作用明显增强,差异极显著(p<0.01),且吞噬指数达0.2。这些结果表明食管癌细胞系(ec9706和kyse150)高表达cd47,抗cd47单抗能够促进巨噬细胞对所研究的食管癌细胞的吞噬作用,为靶向cd47治疗食管癌提供依据。2.噬菌体展示技术筛选和鉴定抗cd47纳米抗体首先采用dna重组技术制备cd47蛋白。以人cd47基因全长cdna克隆为模板,pcr扩增cd47胞外区基因片段,构建pet30a-cd47重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达经镍离子纯化,利用抗cd47单抗进行鉴定。将纯化蛋白对新疆双峰驼进行免疫,获得骆驼抗cd47蛋白的多克隆抗体,用于分析抗体对cd47蛋白的结合情况。其次,采用噬菌体展示技术制备纳米抗体。从采自5头骆驼的外周淋巴细胞中提取rna反转录cdna为模板扩增vhh基因片段,经过psti/noti双酶切后连接到pmecs载体上,电转化tg1大肠杆菌细胞形成vhh天然抗体文库。vhh噬菌体展示文库采用m13ko7辅助噬菌体超感染、扩增以及peg8000沉淀纯化获得。采用亲和淘洗方法,在elisa板上用纯化的重组cd47蛋白对噬菌体展示文库进行三轮筛选,对筛选输出的噬菌体采用多克隆噬菌体elisa测定富集指数。对辅助噬菌体感染后生长在琼脂平板上的阳性克隆,采用菌落pcr和序列测定进行鉴定。阳性纳米抗体基因序列亚克隆到原核表达载体进行诱导、表达和纯化。采用抗c-myc酶标二抗在elisa中检测纳米抗体与重组cd47抗原的结合活性和亲和力。cd47基因经过密码子优化后,经0.2mmiptg诱导,在大肠杆菌bl21(de3)菌株中获得高表达。经ni-离子亲和层析纯化后得到纯度约90%的cd47重组蛋白,并可被抗cd47单抗(b6h12)特异结合。elisa测定cd47蛋白免疫的新疆双峰驼抗血清效价可达1:200000,说明CD47蛋白在骆驼体内能激发免疫反应,为今后构建免疫文库提供基础。从骆驼外周血淋巴细胞中,采用VHH特异引物构建了库容为1.4×109cfu天然VHH纳米抗体噬菌体展示文库,从文库中随机选取91个菌落,测序分析其中有85个VHH抗体,表明文库质量较高。经过三轮亲和筛选,获得了输出量为6.0×104cfu的噬菌体,多克隆噬菌体ELISA结果表明富集指数达10。从第三轮筛选输出噬菌体感染的菌落生长的琼脂平板中随机挑取38个单克隆,进行菌落PCR鉴定和序列测定表明38个均为阳性克隆。挑选其中3个噬菌体克隆,VHH-CD47-201、VHH-CD47-204和VHH-CD47-802,亚克隆到pET30a在BL21(DE3)中进行诱导。表达的蛋白经过SDS-PAGE检测分别在25 kDa、28 kDa和21 kDa出现目的条带,与预期大小一致。纯化后得到纯度约90%的纳米抗体。间接ELISA结果表明,VHH-CD47-201重组纳米抗体能与CD47蛋白结合。本研究首次表明,CD47蛋白在本次研究的食管癌细胞系表面高表达,抗CD47单抗能够促进巨噬细胞对食管癌细胞的吞噬作用。从天然VHH噬菌体文库中可以获得具有一定结合力的抗CD47纳米抗体。该研究为进一步开展纳米抗体抗肿瘤作用打下了基础。
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