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基因扩增是癌基因活化的主要方式,癌基因扩增及过表达与肿瘤发生、演进及预后密切相关。同时,基因扩增与肿瘤细胞的耐药现象关系密切。我们的前期工作证实,在人卵巢癌细胞系UACC-1598中,存在癌基因MYCN的扩增及过表达。为进一步探讨扩增基因在肿瘤发生、发展中的作用机制,寻找与肿瘤抗药性形成相关的基因,本研究对人卵巢癌细胞UACC-1598中MYCN扩增的作用机制及氨甲喋呤(MTX)抗性的小鼠胚胎成纤维细胞中MTX的耐药机制进行了研究。
应用RNA干涉技术特异性封闭人卵巢癌细胞UACC-1598中MYCN的表达。通过荧光标记验证siRNA转染的高效性;RT-PCR、WesternBlot验证MYCNmRNA及蛋白水平的封闭效果均可达80%以上。通过生长曲线绘制、染色体分析、透射电镜观察、Hoechst染色、重组基底膜侵袭实验、流式细胞仪分析细胞周期及凋亡、WesternBlot检测MYCN下游作用因子表达等体外实验方法,分别对MYCN封闭前后的UACC-1598细胞进行检测。结果显示:转染MYCNsiRNA的UACC-1598细胞较未转染组细胞生长缓慢,发生G1期捕获及G2-M期阻滞;细胞侵袭能力下降且发生明显的凋亡。染色体分析发现转染前后细胞遗传学改变不明显,双微体数量无显著变化。WesternBlot分析MYCN封闭前后相关因子表达变化,提示MYCN可通过上调MDM2及P73的表达;下调TP53及Caspase8的表达从而促进细胞增殖,抑制凋亡,增强细胞的侵袭能力,参与肿瘤的发生及演进过程。
同时,应用体外诱导的方法获得小鼠MTX的抗性细胞系,应用细胞遗传学分析及SuperArray微阵列基因芯片技术,对与肿瘤药物耐受及代谢相关的96个基因的表达进行了快速、全面的检测。通过相关软件分析,得到具有明显表达差异的基因,应用WesternBlot对存在明显表达差异的基因在蛋白水平上加以验证。结果表明:DHFR、ATM、MRP5、TP53等基因在MTX抗性细胞中表达增强,提示它们与MTX的抗药性密切相关,可能分别通过双微体的形成、靶基因的扩增、DNA损伤修复机制的增强、多药耐药相关蛋白介导药物外排及调节细胞周期关卡、凋亡和维持基因组完整性等方面参与MTX耐药性的产生。