由创伤、感染、肿瘤、烧伤等引起的大块骨缺损是临床治疗的棘手问题,采用传统的自体骨或同种异体骨移植及生物材料填充,由于存在种种弊端,治疗效果均不理想,严重限制了其临床应用。组织工程技术的兴起为解决这一难题带来了希望,成为当前的研究热点。然而,大块组织工程骨血管化以及生长因子持续稳定的释放等关键性技术难题至今未找到理想的解决办法。显然,采用常规的思路对大块骨缺损进行修复遇到了巨大的挑战。为了找到一条可供临床用来修复大块骨缺损的组织工程之路,本研究力图探索出一条基于整体论和还原论相结合的骨组织工程研究的创新之路,并率先建立近同构模型——体内灌注诱导成骨微环境系统。基于这种认识,我们开展了以下一系列研究:第6章:山羊骨髓基质干细胞的体外培养目的:将来源于山羊的骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSC),在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞,观察其生物学特性,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值。方法:抽取健康山羊骨髓采用全骨髓法进行培养扩增,传代后改用含地塞米松(10-8mol/L),β-甘油磷酸钠(10mmo1/L)和维生C (50mg/L )的条件培养基促使其向成骨细胞定向诱导分化。在相差显微镜、HE染色、光镜下观察细胞形态,并测定培养细胞的生长曲线(MTT法),流式细胞术进行细胞表面特征鉴定,Gomori钙钻法进行ALP染色、Von Kossa法进行钙结节染色,同时测定细胞内ALP含量变化。结果:原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力。诱导培养2-3周后,细胞生长良好,生化指标稳定,光镜下表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征。流式细胞术证明BMSC细胞膜抗原CD29, CD44, CD105表达阳性,而CD14, CD34和HLA-DR表达阴性,ALP及钙结节染色等均为强阳性;ALP活性明显增强(P<0.01)。结论:山羊BMSC取材安全方便,在特定条件诱导下,可定向诱导分化为具有典型形态学特点和功能的成骨细胞,山羊BMSC可作为理想的骨组织工程种子细胞来源。第7章:rhBMP-2及rhbFGF对山羊骨髓基质干细胞增殖的效应目的:检测rhBMP-2和rhbFGF单独及联合作用对山羊骨髓基质干细胞(BMSC)增殖的效应。方法:采用MTT法检测单独及联合施加rhBMP-2和rhbFGF后,BMSC在第1, 3, 5, 7及10天增殖的状况,并进行统计学分析。结果:rhBMP-2和rhbFGF均能显著地促进BMSC的增殖,并呈剂量依赖性。两种生长因子联合作用的效应高于单独作用的效应。结论: rhBMP-2和rhbFGF具有协同促进山羊BMSC增殖的效应。第8章:rhBMP-2及rhbFGF对山羊骨髓基质干细胞分化的效应目的:检测rhBMP-2和rhbFGF单独及联合作用对山羊BMSC的分化效应。方法:采用碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒及考马斯亮兰测定法检测单独及联合施加rhBMP-2和rhbFGF后,BMSC在第2,5,7及10天时的ALP活性及蛋白质含量水平以反映对细胞分化作用的影响,并进行统计学分析。结果:rhBMP-2能在较长时间内明显促进细胞ALP活性及蛋白质含量,而rhbFGF则起到抑制作用,且均呈剂量依赖性。rhBMP-2单独作用与两种生长因子联合作用的效应相近,均高于rhbFGF单独作用的效应。结论:rhBMP-2和rhbFGF联合应用与rhBMP-2单独使用均能够显著地促进山羊BMSC的分化效应。第9章:增强型绿色荧光蛋白基因质粒转染骨髓基质干细胞目的:探讨以脂质体介导法转染的增强型绿色荧光蛋白质粒作为骨组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法:选取12月龄中国青山羊2只作为BMSC供体。将已转染pEGFP-N2的大肠杆菌109菌种,进行质粒提取并经AvaⅡ酶切鉴定。脂质体(lipofectamine 2000)介导转染羊BMSC细胞。分别于转染24h、6月后计算荧光的转染效率。以未标记的同期细胞作对照。结果:质粒经酶切后电泳,可见三条带,分别为445bp,1938bp,2354bp,确定所提质粒为pEGFP-N2。转染24h后绿色荧光表达率35%;经G418筛选,转染6个月后绿色荧光表达率75%,同时对照组未观察到绿色荧光。结论:脂质体介导法转染的pEGFP-N2标记BMSC,是一种理想的标记方法。第10章:增强型绿色荧光蛋白基因质粒标记技术示踪组织工程化骨形成目的:探讨以脂质体介导法转染的增强型绿色荧光蛋白质粒作为骨组织工程种子细胞示踪组织工程化骨形成的可行性。方法:将标记与未标记细胞经成骨诱导分化后,检测碱性磷酸酶(ALP)活性和四环素钙结节染色,以未标记的同期细胞作对照。将标记细胞接种于珊瑚支架,形成BMSC-珊瑚复合物,分别于体外培养4d、7d、14d后进行电镜扫描观察。将体外培养7d的BMSC-珊瑚复合物移植于裸鼠皮下,8周后取出,荧光显微镜下进行示踪观察,HE染色观察组织结构。以未标记的BMSC-珊瑚复合物、单纯珊瑚作对照。结果:与对照组相比,标记细胞碱性磷酸酶活性差异无统计学意义(P> 0. 05),均具有钙结节形成能力。标记细胞与珊瑚材料贴附生长良好,并分泌胶原纤维及钙盐结晶样基质。组织学示新生骨样组织围绕材料孔隙生成;新生组织细胞内有绿色荧光清晰表达,同时对照组未观察到绿色荧光。结论:脂质体介导法转染的pEGFP-N2标记BMSC,可用于裸鼠体内示踪,是一种理想的组织工程化骨组织的示踪方法。第11章:山羊胫骨大节段骨缺损模型的制备目的:为骨组织工程的研究提供理想的动物模型。方法:取9只青山羊随机分3组,制备单侧胫骨25mm的骨膜与骨缺损,重建钢板内固定,术后放射学检查、组织学方法评价骨缺损自行修复情况。结果:术后所有动物骨缺损处x线片Lane评分均为0分,组织学显示无骨组织长人。结论:山羊胫骨适于制备骨缺损和重建钢板内固定模型,其25mm大段骨缺损模型是研究组织工程骨较为理想的动物模型。第12章:近同构模型修复山羊胫骨大段骨缺损的初步研究目的:探索骨组织工程近同构模型修复羊胫骨干骨缺损的可行性。方法:体外扩增自体骨髓基质干细胞,与珊瑚支架材料复合,植入山羊胫骨缺损处,同时通过便携式微量泵联合皮下植入式给药装置,建立近同构模型—可调控的体内灌注诱导成骨微环境系统,定时注入DMEM培养液、细胞因子rhbFGF和rhBMP-2。结果:术后8W观察结果:术后8W组织切片HE染色观察到近同构模型组骨组织形成;对照组仅见纤维组织长入。x线观察,术后8W近同构模型组织工程骨周围形成骨痂,并与胫骨缺损端融合;对照组术后8W时支架材料部分降解、吸收。结论:近同构模型构建的组织工程化人工骨具有修复大动物(羊)负重骨(胫骨)的节段性缺损的可行性。