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第一部分 去氨加压素治疗15例血管性血友病患者的临床观察[目的]探讨去氨加压素(DDAVP)在血管性血友病(VWD)诊断和治疗中的应用价值。[方法]对2016年3月至2018年8月期间15例接受DDAVP治疗的血管性血友病(VWD)患者进行回顾性分析,通过测定血浆VWF抗原(VWF:Ag),瑞斯托霉素辅因子活性(VWF:Rco),VWF胶原结合活性(VWF:CB),因子VIII活性(FVIII:C),VWF:Rco/VWF:Ag,VWF:CB/VWF:Ag,VWF多聚体等,比较患者用药前及用药后2h的临床反应和生物学指标变化,观察药物不良反应。[结果]15例VWD患者中,男7例,女8例,中位年龄23(6～46)岁。9例1型VWD患者中,7例达完全反应;1例2A型VWD患者达完全反应,5例3型VWD患者无反应。对5例患者进行VWF多聚体分析,结合其他VWF相关检测指标,DDAVP治疗效果与患者疾病分型相符合。[结论]DDAVP对1型VWD患者可达到较好疗效,对部分2型VWD及3型VWD患者反应不佳;对血管性血友病的诊断和后续治疗选择具有重要意义。第二部分重组成熟血管性血友病因子质粒的构建及鉴定[目的]血管性血友病因子(von Willebrand Factor,VWF)通过介导血小板与受损内皮之间的连接以及作为血浆凝血因子VIII的载体稳定FVIII,发挥止血作用。大分子量的VWF多聚物具有较好的止血活性。因此,VWF多聚化水平的程度对于VWF止血活性的正常发挥必不可少。VWF序列分析提示其结构域依次为D1-D2-D’-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK 区,其中,VWF 前导肽(VWF propeptide,VWFpp)由D1和D2区构成,成熟VWF由D’区至CK区构成。目前VWF在细胞内如何多聚化、转运及储存,有很多机制不明。本实验拟通过同源重组的方法构建包含成熟VWF片段的质粒,为后续的实验研究奠定分子学基础。[方法]以人野生型(wild type,WT)全长VWFcDNA的pSVHvWF1质粒为模板,对VWF成熟片段(D’-CK区)的开放阅读框(ORF)进行扩增,将扩增后的PCR产物与经HindⅢ和EcoRV双酶切制备的pSecTag2/Hygro B线性载体通过同源重组的方式连接。连接产物直接进行转化,挑取阳性克隆进行菌落PCR及测序鉴定。将正确克隆菌液扩大培养、抽提、测定浓度,获得高纯度质粒,用于后续实验。在HEK293细胞系内对WT-VWF及构建完成的pSecTag2/Hygro B-成熟VWF质粒进行瞬时转染,分别采用酶联免疫吸附试验及VWF多聚体分析对重组质粒转染产物进行鉴定。[结果]构建了重组pSecTag2/Hygro B-成熟VWF,转染并表达于HEK-293细胞。对转染产物进行酶联免疫吸附试验和VWF多聚体分析提示检测到成熟VWF片段。[结论]通过同源重组的方法,成功构建了 cTag2/Hygro B-成熟VWF表达质粒。