鲍鱼内脏蛋白肽的制备及其体外活性研究

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利用鲍鱼内脏制备具有生物活性的蛋白肽,是实现鲍鱼资源综合利用的有效途径。本研究以鲍鱼内脏为原料,通过酶解、超滤制备蛋白肽,初步探讨鲍鱼蛋白肽分离组分和抗氧化活性之间的关系。然后,对鲍鱼蛋白肽进行分离纯化,对获得的抗氧化肽进行质谱分析。最后,考察鲍鱼蛋白肽对氧化损伤的人皮肤细胞和人肿瘤细胞增殖的影响。  首先,本文利用超滤膜对鲍鱼内脏酶解物进行分离,考察了各分子量段酶解物的成分组成和抗氧化活性。利用截留分子量为10000 Da、3000 Da、500 Da的超滤膜分离得到FA、FB、FC和FD四个组分中,FA组分的总糖和蛋白含量分别为34.06%和17.20%,而FB、FC和FD等组分主要是由蛋白组成,其游离氨基酸含量分别高达23.20 g/100 g,25.47 g/100g和28.68 g/100 g。根据Tricine-SDS-PAGE、液相色谱和β-消除反应的分析结果,表明FA组分含有N-糖苷键结合的糖蛋白和分子量25 kDa的蛋白,FB、FC和FD的分子量主要分布在300 Da左右。体外抗氧化结果表明,FD组分具有较好的清除自由基活性。  其次,在鲍鱼内脏蛋白肽小试放大试验中,利用截留分子量为10000 Da、1000 Da、200 Da膜分离得到FA、FB和FC三个组分。FA组分的总糖和蛋白含量分别为21.49%和55.12%,而FB和FC主要由蛋白肽构成。氨基酸组成分析结果显示,在FC组分中疏水性氨基酸(Leu、Phe和Tyr)含量最高。三个分离组分主要含有钾、钠、磷等矿物质。根据蛋白肽抑制亚油酸自动氧化的结果,发现FC组分具有最高的抗氧化能力。FC组分经凝胶柱和反向色谱分离后,获得分子量440.0154 Da酪氨酸肽和分子量522.1545 Da苯丙氨酸肽。  最后,考察了AVP对人皮肤细胞和人肿瘤细胞的影响。结果发现,鲍鱼内脏蛋白肽对HSF细胞的增殖效果明显优于HaCat细胞。在H2O2诱导的细胞氧化损伤模型中,经1.00-4.00 mg/mL的AVP预孵后能明显提高HSF细胞存活率、提高细胞外SOD、GS H-Px以及细胞内SOD活性、降低细胞MDA含量。经0.25-4.00 mg/mL的AVP预孵后虽然能明显提高HaCat细胞存活率,但只有1 mg/mL的AVP能明显提高HaCat细胞外GSH-Px活性以及胞内GSH-Px和SOD活性,并使胞内MDA含量出现一定程度的下降。另一方面,当培养液含浓度>2.00 mg/mL的AVP时,MDA-MB-231细胞和HepG2细胞的生长都得到明显的抑制,而且MDA-MB-231细胞的存活率明显低于HepG2细胞。根据细胞形态学观察的结果,当肿瘤细胞生长受到抑制时,MDA-MB-231细胞会收缩变圆,而HepG2细胞结团数目减少、细胞体积变小,两种细胞都可以发现活细胞减少、凋亡细胞增加。不管是MDA-MB-231细胞还是HepG2细胞,在琼脂糖电泳中都没有发现DNA降解片段。  综上所述,酶解结合超滤制备的鲍鱼内脏蛋白肽具有较好的抗氧化活性,其酪氨酸肽和苯丙氨酸肽是主要的抗氧化成分。低浓度的蛋白肽能促进人HSF细胞和HaCat细胞的增殖,对H2O2诱导氧化损伤的皮肤细胞起到保护作用;高浓度的蛋白肽能抑制人MDA-MB-231和HepG2细胞的增殖。
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