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在我国,脑出血的发病率呈上升趋势,其死残率居各类卒中首位,严重影响了患者生命健康。由于脑出血致病机制复杂,且目前缺乏明确的循证医学指导,其治疗手段十分有限,疗效亦不令人满意。有效清除血肿以减轻血块直接机械作用造成的原发性脑损伤是脑出血治疗的关键。目前清除血肿主要靠外科手段,然而传统的开颅手术在清除血肿的同时,常常带来二次损伤,疗效并不明确。微创手术结合组织纤溶酶原激活剂(tissue-plasminogen activator,t PA)纤溶治疗脑出血,操作简易,对周围正常脑组织损伤小,具有广大前景。但其血肿清除效力不佳,纤溶效率亟待提高。有文献报道,在脑缺血血栓中发现中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps,NETs),其可通过网状结构粘附纤维蛋白,增强血栓对t PA的纤溶抵抗,影响溶栓疗效。而脑出血后是否有NETs存在、NETs是否干扰脑出血后t PA纤溶、降解NETs是否可提高纤溶疗效以使脑出血患者受益均不清楚,有待实验验证。除了原发性损伤,脑出血后继发性损伤的防治也是其治疗的重点。脑水肿作为脑出血后最常见的继发性损伤,可引起患者颅内压增高、加重缺血缺氧反应,严重影响患者预后。目前针对脑出血后脑水肿的治疗主要依靠药物脱水及辅助治疗,其疗效并不明确。对于药物治疗无效的顽固性脑水肿,手术减压可获得一定疗效,但手术本身往往又可造成二次损伤。脑出血后脑水肿治疗至今仍是难题。临床中发现,一旦患者下丘脑受损,其脑水肿往往持续而严重,提示神经内分泌系统参与了脑水肿的发生和发展。下丘脑作为神经内分泌的中枢环节,可释放多种激素,发挥多种作用,其中精氨酸加压素(Arginine vasopressin,AVP)可调节体内水和电解质稳态。有研究发现,脑出血后患者血浆中AVP水平与其脑水肿程度呈正相关,提示AVP参与了脑出血后脑水肿形成。有临床个案报道,给予颅脑外伤患者AVP拮抗剂托伐普坦(tolvaptan)口服,可显著减轻其脑水肿进展,改善预后。tolvaptan有望成为治疗脑水肿的新选择。于是,课题组设计动物实验以验证tolvaptan在脑出血后脑水肿的疗效,一旦动物实验疗效确切,或可开展临床试验,为脑出血后脑水肿提供新的治疗选择。本课题组分别针对清除血肿和减轻脑水肿两个方面,以动物模型为基础,探索脑出血后NETs的分布及其对t PA纤溶的影响,观察tolvaptan对脑出血后脑水肿的疗效,并研究机制,旨在为临床治疗做出参考。一、中性粒细胞胞外诱捕网在大鼠脑出血后纤溶治疗中的作用目的采用大鼠自体血诱导脑出血模型,观察中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)的分布情况,并探索NETs对组织纤溶酶原激活剂(tissue-plasminogen activator,t PA)纤溶治疗脑出血的影响,为提高t PA纤溶效力提供新的靶点。方法本研究分为三个部分。第一部分,分别在脑出血后0.5 h、1 h、1.5 h,取大鼠脑组织标本通过免疫荧光法检测脑出血后NETs的分布情况。第二部分,大鼠随机分为5组:sham组、vehicle组、DNAse 1组、t PA组、t PA+DNAse1组。sham组为假手术组,其余四组分别在脑出血术后1 h给予5μl的生理盐水、DNAse1(400 IE/μl)、t PA(4μg/μl)、t PA+DNAse 1(t PA,4μg/μl,DNAse 1,400 IE/μl)血肿内纤溶治疗。3天后,行MRI及行为学检测,以评价纤溶疗效,并取脑组织标本,通过TUNEL染色,观察血肿周围细胞坏死情况。第三部分,脑出血大鼠随机分为4组:vehicle组、DNAse 1组、t PA组、t PA+DNAse1组。在脑出血造模3天后,取颅内血肿,进行体外纤溶检测。结果1.免疫荧光结果显示,脑出血后1 h即可在血块及血肿周围观察到NETs存在。2.分析磁共振成像图片,发现:t PA纤溶治疗显著促进了血肿清除、降低了脑肿胀指数(t PA vs vehicle,p<0.05);单独使用DNAse1降解NETs并未对血肿体积及脑肿胀指数产生明显影响,但将DNAse1与t PA联合使用,可显著提高t PA的纤溶疗效,进一步促进了血肿清除、缓解了脑组织肿胀(t PA vs t PA+DNAse1,p<0.05)。3.行为学结果显示,t PA纤溶治疗有效缓解了脑出血引起的前肢放置缺陷,改善了动物神经功能预后,而联合使用DNAse1可进一步促进功能改善。4.脑出血3天后血肿旁坏死细胞(TUNEL阳性)明显增多,给予t PA纤溶后,坏死细胞数量呈下降趋势(t PA vs vehicle,p>0.05),而t PA与DNAse1联合治疗进一步减少了血肿旁细胞坏死(t PA+DNAse 1vs vehicle,p<0.05)。5.称重法和分光光度计法均发现,t PA有效地促进了颅内血块体外纤溶,尽管单独使用DNAse 1对体外纤溶无明显影响(DNAse 1vs vehicle,p>0.05),DNAse 1与t PA联合使用可进一步促进t PA体外纤溶效力(t PA+DNAse 1 vs t PA,p<0.01)。结论大鼠脑出血后NETs的存在干扰了t PA纤溶效力,利用DNAse 1降解NETs可增强t PA纤溶疗效:促进血肿清除、减轻脑肿胀、减少血肿周围细胞坏死、改善大鼠功能预后。二、中性粒细胞胞外诱捕网增加t PA纤溶抵抗的机制研究目的采用大鼠自体血诱导脑室出血模型,验证细胞游离脱氧核糖核酸(Cell-free DNA,cf DNA)是中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)增加组织纤溶酶原激活剂(tissue-plasminogen activator,t PA)纤溶抵抗的关键原因。方法本研究分为四个部分。第一部分,通过免疫荧光法检测脑室出血后血块中cf DNA的时空分布情况。第二部分,大鼠随机分为4组:sham组、Blood组、cf DNA组、Blood+cf DNA组。sham组为假手术组,其余3组分别于侧脑室注射等体积(200μl)动脉全血、cf DNA溶液(2μg)、全血+cf DNA(2μg)混合物。术后检测脑室扩张程度、动物行为学变化及患侧脑室周围星形胶质细胞增生情况,以评估外源性cf DNA对大鼠脑室出血的影响。第三部分,大鼠随机分为5组:sham组、vehicle组、t PA组、t PA+DNAse 1组、t PA+cf DNA组。vehicle组、t PA组和t PA+DNAse 1组在自体全血诱导脑室出血1 h后分别给予2μl生理盐水、t PA(10μg/μl)、t PA+DNAse 1(t PA,10μg/μl,DNAse 1,1000IE/μl)脑室内纤溶治疗。t PA+cf DNA组采用自体血+cf DNA(2μg)混合液诱导脑室出血,1 h后给予2μl t PA(10μg/μl)脑室内纤溶治疗。观察指标同上,以评估cf DNA对脑室出血后t PA纤溶治疗的影响。第四部分,脑室内注射全血或全血+cf DNA(2μg)混合液,3天后取颅内血肿,进行体外纤溶实验,以进一步体外验证cf DNA对t PA纤溶作用的影响。结果1.免疫荧光结果显示,脑室出血后1 h即可观察到血块中有cf DNA结构。2.单纯cf DNA(2μg)脑室内注射对大鼠脑室体积(磁共振)、行为功能(m NSS、前肢放置试验)及脑室周围星形胶质细胞增生(免疫荧光)无明显影响(sham vs cf DNA,p>0.05),而将cf DNA(2μg)混入全血中脑室内注射可造成血肿清除延缓、加重大鼠脑室出血损伤(Blood vs Blood+cf DNA,p<0.05)。3.t PA纤溶可显著缓解脑室扩张(磁共振)、改善大鼠神经功能缺损(m NSS、前肢放置试验)、减少脑室周围星形胶质细胞增生(免疫荧光)(t PA vs vehicle,p<0.05),而加入cf DNA或DNAse 1(以降解cf DNA)可分别减弱或增强t PA纤溶疗效,提示cf DNA阻碍了大鼠脑室出血后t PA纤溶。4.将全血或全血+cf DNA混合物脑室内注射,发现混入cf DNA可延缓血块降解(Blood vs Blood+cf DNA,p<0.05),且在体外纤溶实验中表现出明显的纤溶抵抗(Blood+t PA vs Blood+cf DNA+t PA,p<0.05)。结论实验性脑室出血中,cf DNA是NETs增加t PA纤溶抵抗的关键,使用DNAse 1降解cf DNA可增强t PA的纤溶疗效,改善脑室出血大鼠的预后。三、托伐普坦对大鼠脑水肿的作用及机制研究目的利用大鼠胶原酶诱导脑出血模型,观察给予口服托伐普坦(tolvaptan)治疗后,大鼠脑水肿、行为学及血脑屏障相关指标变化情况,明确tolvaptan的疗效,并在大鼠颅脑外伤模型上进一步验证tolvaptan对脑水肿的作用。方法本研究分为三个部分。第一部分,建立大鼠胶原酶诱导脑出血模型,观察tolvaptan的安全性及其对大鼠脑水肿、行为学的影响:SD大鼠随机分为sham组(假手术组)、vehicle组和tolvaptan组。术后12 h、36 h、60 h,对照组和给药分别给予1.5 ml饮用水或tolvaptan药液(10 mg/kg)灌胃处理。利用磁共振及脑水含量(brain water content,BWC)检测药物对脑水肿的影响,并对动物进行改良的大鼠神经功能缺损评分(m NSS)、前肢放置试验及转角试验,以评价动物神经功能预后。第二部分,建立大鼠胶原酶诱脑出血模型,观察tolvaptan对大鼠血脑屏障的保护作用:分组及药物处理同上,术后利用伊文斯蓝(Evans blue,EB)渗透试验观察血脑屏障通透性,并对血脑屏障相关蛋白的表达进行定量分析。第三部分,建立大鼠颅脑外伤模型,观察tolvaptan对大鼠颅脑外伤后脑水肿及行为学改善的作用:分组、药物处理及观察指标同第一部分。结果1.通过检测给药前后大鼠生命体征,发现tolvaptan对正常(假手术组)及脑出血大鼠体重及平均动脉压无明显影响。2.通过磁共振图像分析及BWC测定,发现tolvaptan可显著减轻脑出血后脑肿胀指数及患侧半球BWC(vehicle vs tolvaptan,p<0.05),提示tolvaptan有效减轻了脑出血后脑水肿程度。此外,通过m NSS、前肢放置试验及转角试验评分,发现tolvaptan可显著改善脑出血大鼠神经功能缺损。3.Tolvaptan可减轻脑出血导致的EB染料经微血管外渗出,增加血脑屏障相关紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达,同时下调脑出血后MMP-9的表达(vehicle vs tolvaptan,p<0.05),提示tolvaptan对脑出血后血脑屏障具有一定保护作用。4.Tolvaptan显著减轻了颅脑外伤后大鼠脑肿胀指数及患侧半球BWC,改善了动物m NSS评分(vehicle vs tolvaptan,p<0.05),提示tolvaptan对颅脑外伤后脑水肿同样有效。结论托伐普坦可有效减轻脑出血及颅脑外伤后脑水肿,改善大鼠神经功能,机制可能与其对血脑屏障的保护作用有关。