甲状腺激素受体相互作用因子4(TRIP4)是核转录共活化因子1复合物(ASC-1)的亚基,介导核受体相互作用,促进基础转录因子转录。近年来研究表明,TRIP4在多种肿瘤中高表达,并可能与肿瘤的发生发展有关,基因芯片数据库显示TRIP4在宫颈癌组织中的表达高于宫颈正常上皮组织。其下游可能与NF-κ B通路相关,并调节肿瘤细胞的增殖、侵袭。然而,TRIP4在调节宫颈癌生长作用和辐射抗性中的作用未曾有报道过,其对肿瘤作用的机制研究也鲜有报道。最常见的发现是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径的异常,并且在这些具有突变的患者中观察到更短的存活时间。宫颈癌细胞的增殖、侵袭能力与MAPK、PI3K/AKT信号通路密切相关。放疗是现代宫颈癌治疗的主要治疗手段,完善的放射治疗模式大大提高了宫颈癌患者的存活率。但未来肿瘤的治疗不仅局限于单一治疗手段,越来越多的证据表明,多学科综合治疗是进一步提高治疗效果的有效方法。因此,寻找能够降低放射抵抗或辅助放疗的综合治疗手段成为现代医学的重要目标。以往的研究表明,hTERT通路的激活,是宫颈癌患者产生放疗抵抗的原因之一,那么寻找一个能够抑制hTERT通路的基因或许可以提高宫颈癌的放射敏感性。因此,本研究将TRIP4鉴定为宫颈癌的潜在靶点,并探讨其在宫颈癌生长和发展中的作用和分子机制。探讨对TRIP4基因抑制后,对宫颈癌MAPK、PI3K/AKT信号通路的影响,并寻找TRIP4基因调节肿瘤生物学特性的原因。同时通过各种表型实验和机制实验,讨论TRIP4基因对hTERT信号通路的调节作用,进而如何调节其对宫颈癌放射治疗的影响。最后,本研究再通过对成瘤裸鼠的放射治疗,探讨TRIP4与各通路关键基因的关系,进一步在动物实验中验证以上问题。目的:1.研究TRIP4基因在宫颈癌组织和细胞中的表达,并分析其对宫颈癌细胞的增殖、凋亡和迁移的影响。2.研究TRIP4基因与MAPK、PI3K/AKT信号通路和hTERT信号通路的关系3.研究TRIP4基因对实验动物和宫颈癌患者的影响方法:第一部分:TRIP4基因在宫颈癌中的表达及其对宫颈癌细胞的影响1.随机选取15例宫颈癌患者肿瘤组织和相应癌旁组织,提取两组样本组织的总蛋白,通过Western Blot实验和免疫组化实验验证TRIP4在不同组织中的表达。2.选取 6 种宫颈癌细胞系(HeLa,SiHa,Caski,DoTc2,HeLa S3,C33A)和 1种人正常宫颈上皮细胞Ect1进行培养,提取对应组织蛋白,通过Western Blot实验验证不同宫颈癌细胞中TRIP4的表达情况。3.通过TRIP4特异性SiRNA敲低TRIP4在HeLa和SiHa细胞中的表达,通过平板克隆形成实验、MTT实验、流式细胞凋亡实验和AO/EB染色实验观察TRIP4敲低后,两种细胞系增殖能力、细胞活力和凋亡情况,并通过Western Blot实验观察与相应表型相关的关键蛋白表达情况。4.应用Transwell实验、划痕实验和免疫荧光实验观察TRIP4敲低后HeLa和SiHa细胞的迁移侵袭能力,并通过Western Blot实验观察与相应表型相关的关键蛋白表达情况。5.通过TRIP4特异性质粒过表达TRIP4在HeLa和SiHa细胞中的表达,重复上述实验观察TRIP4基因在两种细胞系中过表达后对肿瘤细胞增殖、侵袭等生物学特性的影响。第二部分:TRIP4基因与MAPK、PI3K/AKT、hTERT信号通路的关系和对放射敏感性的影响1.使用细胞培养技术培养HeLa和SiHa细胞,通过TRIP4特异性SiRNA敲低TRIP4在HeLa和SiHa细胞中的表达,通过Western Blot验证细胞中TRIP4表达被明显敲低。2.将HeLa和SiHa两种细胞分为未处理组(Mock),无SiRNA对照组(NC),有效敲低Si1组(Si1)和有效敲低Si2组(Si2)。待细胞培养至铺满10cm培养皿80%时进行敲低转染处理。继续培养48小时后消化收集细胞。3.提取两种细胞各4组对应细胞的总蛋白,BCA细胞定量后,通过Western Blot实验观察MAPK、PI3K/AKT信号通路的关键蛋白表达情况。4.取6cm培养皿传代培养HeLa和SiHa细胞,两种细胞各分成Mock、Mock+IR、Sil和Si1+IR四组,每组5个副皿,每皿铺板约1000个细胞用于克隆形成实验,其中IR组在细胞集落形成后进行2Gy、4Gy、6Gy和8Gy放疗1次,最后拍照计数细胞集落,制成放射存活曲线。5.将HeLa、SiHa两种细胞分为对照组和处理组组,应用彗星实验,荧光拍照后应用软件测量电泳后细胞拖尾长度,并进行统计定量分析,同时应用Western Blot检测DNA损伤修复蛋白Rad51和p-H2AX的表达变化。6.用TRIP4-siRNA(si-TRIP4)或表达TRIP4的质粒转染HeLa和SiHa细胞,通过Western Blot印迹检测TRIP4和hTERT蛋白水平的表达。用TRIP4-siRNA和hTERT启动子驱动的荧光素酶(-2053/+40)质粒共转染HeLa细胞并检测荧光素酶活性。在HeLa细胞中使用hTERT启动子进行染色质免疫沉淀测定,在HeLa细胞中使用抗TRIP4抗体通过蛋白质印迹检测核蛋白-hTERT探针-链霉抗生物素蛋白珠复合物中的TRIP4蛋白。从位置-2053 到+40 的 5’DNA 片段(-2053/+40,-1655/+40,-902/+40,-321/+40,-234/+40,-144/+40)将人hTERT基因构建成启动子驱动的荧光素酶表达载体pGL3。用TRIP4和不同的hTERT启动子驱动的荧光素酶质粒共转染HeLa细胞,并通过荧光素酶报告基因测定试剂盒检测荧光素酶活性。第三部分:研究TRIP4基因对实验动物和宫颈癌患者的影响1.在用非特异性对照shRNA或TRIP4shRNA转染后,通过蛋白质印迹分析HeLa细胞中TRIP4和hTERT的表达。雌性裸鼠在左腋下植入肿瘤,每天测量肿瘤体积和小鼠体重。21天后取材,切除成瘤,称重,拍照,记录,最后统计分析数据。2.处理后第21天收获具有HeLa细胞的异种移植物,测量肿瘤体积和重量,并获得4组肿瘤组织大体图片。3.每组取部分抑制瘤制作石蜡切片用于免疫组化染色,部分组织提取总蛋白用于免疫印迹,剩余组织保存在甲醛固定液中。4.通过蛋白质印迹检测裸鼠肿瘤组织中TRIP4,hTERT,p-AKT,p-ERK和p-H2AX蛋白的表达水平。检测各组裸鼠肿瘤组织中TRIP4,hTERT,p-AKT,p-ERK和p-H2AX表达的免疫组织化学并分析。5.通过免疫组化染色分析来自宫颈癌组织及其相应的邻近正常组织的组织芯片中的TRIP4和hTERT蛋白表达的表达。6.通过对数秩检验分析和Kaplan-Meier分析具有不同TRIP4表达的宫颈癌患者的总生存期。通过对数秩检验分析和Kaplan-Meier分析具有不同TRIP4和hTERT表达的宫颈癌患者的总生存期。结果:第一部分:1.TRIP4在宫颈癌细胞系和肿瘤组织中高度表达,随机抽取15例宫颈癌患者,肿瘤组织中TRIP4高表达9例,低表达6例,癌旁组织中高表达7例,低表达8例。1种宫颈上皮细胞系和6种宫颈癌细胞系中,宫颈癌细胞中TRIP4表达明显高于宫颈正常上皮细胞。随机抽取5例宫颈癌患者的免疫组化结果显示,TRIP4表达在癌组织中高于癌旁组织(P<0.05)。2.瞬时转染敲低的HeLa细胞系和SiHa细胞系的TRIP4蛋白,平板克隆实验和MTT实验显示敲低组增殖能力较对照组减弱(P<0.05)。3.对瞬时转染敲低TRIP4蛋白的HeLa细胞系和SiHa细胞系行FACS流式细胞分析,TRIP4的敲低导致凋亡细胞增加约5%-20%,相比对照组有统计学意义(P<0.05)。通过AO/EB染色比较TRIP4敲低组的宫颈癌细胞的损伤程度,TRIP4敲低组的核DNA中积累了更明亮的橙红色荧光,图像分析软件发现两组染色差异有统计学意义(P<0.05)。通过免疫印迹分析了凋亡相关分子,TRIP4的敲低有效地增加了 Bax,casepase-3,casepase-9 和 cleaved-PARP 的水平,但是降低了 Bcl-2 水平(P<0.05)。4.Transwell和划痕实验显示,瞬时转染敲低TRIP4蛋白的HeLa细胞系和SiHa细胞系,侵袭、迁移能力减弱,减弱程度有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光显示HeLa和SiHa细胞系瞬转敲低TRIP4后,E-cadherin表达增多,N-cadherin表达降低。免疫印迹显示HeLa和SiHa细胞系瞬转敲低TRIP4后,检测EMT相关蛋白表达发现TRIP4的敲低有效地增加了 E-cadherin 水平,但降低了 MMP-9,MMP-I,Slug,Snail,β-catenin和N-cadherin水平(P<0.05)。同时过表达HeLa细胞系和SiHa细胞系的TRIP4后,Transwell和划痕表型出现侵袭、迁移能力增强,克隆形成实验也表现出两种癌细胞的增殖能力增强(P<0.05)。第二部分:1.瞬时转染敲低的HeLa细胞系和SiHa细胞系的TRIP4蛋白,瞬转敲低组的PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路关键蛋白表达同对照组有明显差异(P<0.05)。瞬时过表达HeLa细胞系和SiHa细胞系,过表达组的PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路关键蛋白表达同对照组有明显差异(P<0.05)。提示抑制TRIP4后PI3K/AKT和MAPK/ERK和信号通路被抑制。2.在瞬时转染敲低HeLa细胞系和SiHa细胞系的TRIP4蛋白情况下,对实验组和对照组细胞进行辐照,放射存活曲线提示TRIP4敲低组的存活率较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。彗星实验显示TRIP4敲低组的彗尾较对照组延长,提示DNA损伤增多,细胞修复DNA能力减弱。免疫印迹检测对照组和实验组细胞的Rad51和p-H2AX蛋白,在TRIP4敲低时,DNA修复蛋白的表达受到抑制(P<0.05)。3.瞬时转染敲低的HeLa细胞系和SiHa细胞系的TRIP4蛋白,免疫印记实验检测hTERT蛋白表达抑制,同时过表达HeLa细胞系的TRIP4蛋白,hTERT蛋白表达增多(P<0.05)。当用hTERT启动子驱动的荧光素酶质粒转染具有稳定TRIP4敲低或过表达的HeLa细胞,观察到敲低显著抑制hTERT启动子驱动的荧光素酶表达(P<0.05)。使用HeLa细胞中的hTERT启动子进行染色质免疫沉淀测定,hTERT启动子扩增,表明TRIP4与hTERT启动子结合。DNA-蛋白质pulldown测定法和染色质免疫共沉淀(ChIP)实验进一步证实了 TRIP4与hTERT启动子的结合。4.构建了 6种不同长度的hTERT启动子驱动的荧光素酶报告载体,将表达TRIP4的质粒和由hTERT启动子驱动的荧光素酶报告基因共转染到HeLa细胞中,用TRIP4和hTERT(-2053/+40,-1655/+10和-321/+10)荧光素酶质粒共转染的细胞中荧光素酶表达更高(P<0.05)。第三部分:1.构建稳定转染敲低TRIP4基因的HeLa细胞系,建立裸鼠移植瘤模型并给予辐照治疗,根据裸鼠体重获得实验组和对照组的生长曲线和放射存活曲线(P<0.05),放射增敏系数(Enhanced factor,EF)1.66。2.通过免疫印迹检测和免疫组化分析检查了 TRIP4敲低对移植瘤中肿瘤相关蛋白水平表达的影响,结果显示TRIP4敲低减弱了 hTERT,p-AKT,p-ERK和移植瘤的p-H2AX表达(P<0.05)。3.调查128例宫颈癌患者的组织芯片,应用免疫组化染色对比癌组织和癌旁组织的TRIP4蛋白和hTERT蛋白表达量,65名患者表达TRIP4和hTERT的高表达,占所有测试病例的51%,确定了 TRIP4表达与临床病理学变量之间的关系,TRIP4的表达与肿瘤体积和TNM分期相关。总体存活(Overall survival,OS)分析显示,具有低TRIP4和hTERT表达的患者具有显著更高的OS和更长的存活(P<0.05)。结论:第一部分:1.TRIP4在宫颈癌细胞系和肿瘤组织中高度表达。2.抑制TRIP4的表达能够抑制宫颈癌细胞的增殖。3.抑制TRIP4的表达能够促进宫颈癌细胞凋亡。4.抑制TRIP4的表达能够抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭。第二部分:1.TRIP4通过MAPK和PI3K/AKT信号通路在体外促进宫颈癌细胞生长和存活。2.抑制TRIP4能够增加宫颈癌细胞中的DNA损伤和放射敏感性。3.TRIP4调节hTERT的转录活性和表达。4.TRIP4通过调节hTERT表达,以调节宫颈癌细胞中的DNA损伤和放射敏感性。第三部分:1.敲低TRIP4能够在小鼠模型中下调hTERT表达来抑制宫颈癌进展。2.裸鼠移植瘤模型显示TRIP4敲低后,增殖、凋亡、侵袭和DNA损伤修复相关蛋白表达抑制。3.TRIP4与临床组织样本中hTERT表达呈正相关,TRIP4/hTERT高表达预示宫颈癌预后不良。