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刺五加多糖(ASPS)是从刺五加根茎叶中分离出的主要活性成分,具有调节动物免疫机能、抗氧化、抗肿瘤和抗感染等功效。目前对于刺五加多糖的研究多集中于人类医学领域,其在畜禽业上的应用研究较少。由于吉林省是我国家禽养殖的主要省份,刺五加又是吉林省长白山地区物美价廉的道地药材,因此结合刺五加的功效及其安全、绿色和环保的特点,将其应用于养殖过程中具有重要意义,是绿色饲料添加剂开发的重要方向。为了全面评价ASPS对鸡的免疫调节作用并探究可能的作用机制,本研究应用HE染色方法从器官和组织水平观察ASPS对免疫器官和黏膜淋巴组织组织结构的影响;应用免疫组织化学方法、流式细胞术以及淋巴细胞转化等实验方法,从细胞水平分别观察ASPS对T、B淋巴细胞在脾脏中的定位分布、血液中CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的含量以及血液中淋巴细胞的增殖功能等指标的影响;应用血凝抑制试验和荧光定量PCR技术,从分子水平分别研究ASPS对免疫雏鸡抗体效价和细胞因子mRNA表达水平的影响;为进一步揭示ASPS的免疫调节机制,本研究通过体外实验观察ASPS对体外分离培养的淋巴细胞增殖功能、细胞因子mRNA表达水平的影响,并利用TLR2、TLR4抗体和NF-κB阻断剂PDTC与ASPS共处理体外培养的淋巴细胞后,观察各种细胞因子mRNA表达量的变化,探究可能的信号通路,从而初步揭示ASPS的免疫调节机制,为将该多糖开发为鸡新型的免疫调节剂提供重要依据。1.器官组织水平证明ASPS具有免疫增强作用:ASPS可以明显促进胸腺、脾脏和法氏囊等免疫器官以及盲肠扁桃体、BALT和CALT等黏膜淋巴组织的器官指数及组织结构发育;ASPS还可以修复CTX造成的免疫器官和黏膜淋巴组织的组织结构损伤。2.细胞水平证明ASPS具有免疫增强作用:ASPS能够增加正常免疫雏鸡和CTX免疫抑制雏鸡脾脏中T、B淋巴细胞的数量,并能够影响其在PALS、EALS等脾脏特征性结构中的定位分布;ASPS能够显著增加正常免疫雏鸡和CTX免疫抑制雏鸡血液中CD4+T淋巴细胞的数量,但对CD8+T淋巴细胞数量影响不大,同时CD4+/CD8+淋巴细胞比值在ASPS作用下显著升高,因此ASPS能够显著增强由CD4+细胞(Th细胞)介导的免疫功能;ASPS能够在体显著增加正常免疫雏鸡和CTX免疫抑制雏鸡血液T、B淋巴细胞的增殖功能,而且高剂量ASPS的免疫增强效果更佳;ASPS还可以单独或协同PHA或LPS促进淋巴细胞体外增殖,并且ASPS在浓度为200μg/ml时效果最好。3.分子水平证明ASPS具有免疫增强作用:ASPS能够增加正常免疫雏鸡和CTX免疫抑制雏鸡的ND-HI抗体效价,尤其是免疫后21天时,增加效果最为显著,因此ASPS具有显著提高体液免疫功能的作用;ASPS能够不同程度的促进细胞因子的mRNA表达,Th1类细胞因子IFN-γ、IL-2具有变化早、幅度大、后期下降的特点,而Th2类细胞因子IL-4、IL-10具有变化晚、幅度小、后期升高的特点;炎性细胞因子IL-1β、iNOS和TNF-α具有稳步升高的特点,而IL-6升高幅度最大。4.ASPS促进细胞因子mRNA表达的可能机制:IL-1βmRNA表达的机制可能为:ASPS可以与免疫细胞上的TLR2受体结合,经TLR2→TRAF6→IKKc→NF-κB通路活化NF-κB,调控IL-1β在细胞内的转录和表达;IL-10、iNOS和TNF-αmRNA表达的机制可能为:ASPS可以与免疫细胞上的TLR4受体结合,经TLR4→TRAF6→IKKc→NF-κB通路活化NF-κB,调控IL-10、iNOS和TNF-α在细胞内的转录和表达;IL-2、IFN-r、IL-4和IL-6通过本试验不能确定其具体通路,还有待于进一步研究。结合以上部分研究结论分析得出,ASPS能够通过与TLR2和TLR4结合,活化NF-κB,促进IL-1β、IL-10、iNOS和TNF-α等细胞因子的产生,进而促进Th1细胞的活化、增殖,这可能是本研究同时发现的ASPS能够显著增加血液中CD4+T淋巴细胞数量的直接原因,另外Th1细胞的活化增殖会分泌更多的IL-2和IFN-γ,当这些Th1类细胞因子大量分泌时,Th2细胞又会被激活,从而产生IL-4和IL-10等细胞因子,而这些细胞因子又具有抑制Th1类细胞活性的作用,减少Th1类细胞因子的产生,从而使机体的免疫功能维持正常状态,这个过程是ASPS对整个机体免疫调节的可能机制。