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结核病是在全世界范围内流行的致死性细菌传染疾病,每年导致二百万人死亡,由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）感染引起。MTB具有不同寻常的休眠（Dormancy）能力,造成三分之一的人群潜伏感染有结核,并使治疗周期达半年以上。近几年,人们发现三元信号系统DosR/DosS/DosT参与了MTB的休眠调控,然而MTB胞内还存在其它未知的休眠调控机制。深入研究和揭示MTB的休眠机理,能为疫苗开发、新药研制提供理论基础和技术支撑,对于结核病疫情控制、缩短治疗周期具有重大意义。环二鸟苷酸（c-di-GMP）是只存在于真细菌的胞内二级信使,调控原核生物的致病力、生物膜形成、运动性等群体行为。然而,c-di-GMP作为信号分子在MTB中的生理作用及调控机理研究尚未见报道。我们预测MTB基因组含有1个潜在的c-di-GMP合成酶基因和1个降解酶基因,它们在所有MTB菌株间均相同,在标准毒力株H37Rv、减毒株H37Ra中的编号分别为Rv1354c、Rv1357c和MRA1362.MRA1365。Rv1354c由GAF. GGDEF和EAL3个结构域组成,Rv1357c仅有EAL结构域。在大肠杆菌中异源表达获得具有活性的可溶性Rv1354c为二聚体形式,在体外能将GTP或GDP转化生成c-di-GMP,在还原状态下Rv1354c具有更高的酶活力。构建基因敲除质粒,经多次筛选获得不带任何外源标记的敲除突变菌株ARa1362和ARa1365,并将相应基因回补获得回补菌株Com-Ra1362和Com-Ra1365。基因突变株、回补株与野生型（WT） H37Ra在体外的生长速率没有明显差别。培养至生长中后期样品总RNA进行全基因转录本芯片分析,结果表明,△Ra1362、△Ra1365与WT H37Ra或各自基因回补株相比,均有较多基因发生差异表达。有趣的是,ARM362在下调表达较明显的系列基因中有近半数属于已知与MTB休眠相关的基因,这些基因的表达缺陷能被c-di-GMP合成基因回补（Com-Ra1362）得以逆转,也能被外源添加的人工合成c-di-GMP逆转。并且,c-di-GMP降解基因（MRA1365）敲除后,部分休眠基因发生了上调表达,与c-di-GMP合成基因敲除获得的结果相反。将各菌株培养至OD600=1.6,定量RT-PCR分析结果表明,与WT H37Ra、Com-Ra1362相比,部分休眠基因在△Ra1362中确实下调表达。MTB在低氧下能形成生物膜,在贴壁生物膜的形成能力方面,△Ra1362> WT H37Ra>△Ral365;同样,气液面生物膜发育速度方面,△Ra1362>WTH37Ra>△Ra1365:培养21d,△Ral362在气液面已经呈现较丰满的褶皱和突起等典型生物膜结构,而WT H37Ra和△Ra1365只有一薄层菌膜,但35d后3个菌株的生物膜表观上没有明显差异。在体外厌氧模型中,ARa1362消耗氧气（160h）的速率快于WT H37Ra（172h）；两者的NADH水平基本相当,但开始进入低氧阶段（第6d）,ARa1362的NAD水平及NAD/NADH比率开始低于WT H37Ra。在第8-10d,ARal362的CFU仅有WT H37Ra的5-10%,且低氧阶段的ARa1362在平板上形成肉眼可见克隆所需的时间比WT H37Ra长5-7d。定量RT-PCR分析表明,尽管厌氧初期时ARal362中休眠基因正调控因子dosR水平略高于WT H37Ra,但是受其调控的部分休眠基因的表达水平反而低于WT H37Ra。Rv0195为c-di-GMP的靶基因,是LuxR家族的转录因子,预测其为可能的c-di-GMP受体。在H37Rv中将Rvl357c、Rv0195和Rv1354c的GAF.GGDEF结构域序列分别敲除,进行生理学功能验证。基因敲除基本不影响MTB对人源THP-1细胞的侵染和胞内增殖过程,但在侵染的早期和中期,△Rv1354c-GGDEF和ARv1357c感染后THP-1细胞分泌的细胞趋化因子白介素IL-8水平明显高于WT H37Rv。△Rv1357c感染SPF级C57BL/6小鼠,引起脾脏膨大程度前期没有WTH37Rv明显,后期逐渐相同,但ARv1357c感染引起肺脏膨大相比WT H37Rv更为显著。感染6w的组织学染色结果表明,ARv1357c感染在肺部和脾脏引起的病变相比WT H37Rv较为明显。同时,ARv1357c在肺部和脾脏的前期增殖弱于WT H37Rv,但在感染第3w接近后者；感染前6w,ARv1357c在两种组织中的CFU数明显少于WT H37Rv,在感染第10w时,从脾、肺中分离的△Rv1357c在平板上几乎已不能重新恢复生长形成菌落,培养至7-8w仍未观察到菌落生成,而WT H37Rv在3-4周已形成正常菌落。ARv0195感染导致小鼠脾脏膨大的程度与WT H37Rv没有区别,但肺部膨大程度明显弱于后者。与ARv1357c不同,ARv0195感染小鼠的肺部和脾脏的病变明显弱于WT H37Rv。与ARv1357c类似的是,ARv0195在肺部和脾脏的前期增殖稍弱于WT H37Rv,在第3w接近后者,但感染10w的脾肺中分离出的△Rv0195在平板上已完全不能重新恢复生长形成菌落。以上结果说明,MTB胞内c-di-GMP合成酶通过GAF结构域感应低氧条件下胞内的氧化还原压力水平,调控c-di-GMP的合成水平,进而通过信号转导调控MTB的生物膜发育、低氧下的休眠能力和小鼠致病力,通路中的关键调节因子（c-di-GMP合成酶、受体转录因子和降解酶）维持特定生理阶段的c-di-GMP水平对于MTB休眠能力和毒力调节可能是必需的。c-di-GMP信号通路的关键调控因子（Rv1354c、Rv0195和Rv1357c）是有开发潜力的、有效针对MTB休眠/潜伏感染的新型药物靶标。