论文部分内容阅读
植物成花调控机理在草本模式植物(如拟南芥、水稻)以及一些核心真双子叶植物和单子叶植物中有比较深入的研究,而对木本植物与基本真双子叶植物的研究和了解非常少。悬铃木为山龙眼目悬铃木科木本植物,属于进化地位较为原始的基本真双子叶植物类群,它不仅在进化地位上具有特殊性,在园林应用中也具有十分重要的地位,被广泛用作行道树和庭荫树,有’世界行道树之王’之美誉。然而,悬铃木落花落果问题日益突出,对其开花调控机制进行系统研究,进而培育无花无果植株显得十分迫切和重要。本研究依据模式植物的研究成果和悬铃木花芽分化前后基因表达谱分析,对悬铃木开花调控相关基因(包括FT/TFL1家族基因、MADS-box成花调控相关基因以及LFY/UFO同源基因)的功能和进化进行了较为系统的研究,为全面揭示悬铃木开花调控机理以及进一步了解植物开花调控关键基因的系统进化奠定了基础,同时为通过基因工程技术改良悬铃木落花落果问题提供了理论依据。主要研究结果如下:1、通过同源克隆、转录组测序,结合RACE和Tail-PCR技术,克隆了 5个悬铃木FT/TFL1-like基因,系统进化分析结果表明,其中3个属于TFL1-like分支(分别命名为PlacTFLla、PlacTFLlb和PlacBFT),2个属于MFT-like分支(命名为PlacMFTl和PlacMFT2)。qPCR分析结果显示,它们具有明显不同的时空表达模式,3个TFL1-like基因主要在营养器官中表达,其中PlacTFL1α的表达量明显高于PlacTFLlb,表达部位也较广:PlacBFT在成年植株当年生枝条的嫩茎中表达量最高,其次为幼年植株的各个营养器官。2个MFT-like基因主要在果实中表达,且PPlacMFT2仅局限于果实中表达。异源转基因研究表明,3个TFL1-like基因都具有明显的开花抑制功能,2个MFT-like基因都具有一定开花促进功能。蛋白互作研究表明,只有PlacTFLla和PlacFDLl可能存在一定互作,说明悬铃木PlacTFLla基因可能具有更加保守的TFL1功能和作用方式。2、通过同源克隆、转录组测序,结合RACE技术,克隆了 5个悬铃木SOC1-like基因,命名为PlacSOCla/b/c/d/e。除表达水平存在较大差异外,它们在多数组织部位和发育时期的表达模式总体上比较相似。除PlacSOCla在生殖器官中有比较明显的表达外,它们主要在营养组织表达。转基因结果显示,超表placSOC1a/b/e可以导致拟南芥明显早花,而35S:PlacSOClc/d转化拟南芥没有出现明显的早花表型,少数转化体甚至出现晚花表型。酵母双杂结果表明,PlacSOC1a/b/e可以与PlacSVP1发生互作,而PlacSOClc/d与PlacSVP1没有互作,与转基因拟南芥的表型变化一致。PlacSOClc转化拟南芥虽不影响开花时间,但部分转基因株系出现明显花器官发育变异,而PlacSOC1c能与PlacAGL6a/b蛋白发生互作,因此,超表PlacSOC1c影响花器官发育可能与E类基因的调控有关。3、通过同源克隆、转录组测序,结合5’ Tail和3’ RACE延伸,克隆了 3个悬铃木SVP-like基因的全长,命名为PlacSVP1/2/3。qPCR研究结果显示,悬铃木SVP-like基因主要在营养组织中表达,其中PlacSVP1和PlacSVP3在花芽分化前期的柄下芽和顶芽中表达量逐渐增加,而PlacSVP2在此期间表达量逐步下降。说明PPlacSVP2可能具有维持营养分生组织生长活性和抑制花芽分化的功能,而PlacSVP1和PlacSVP3则可能具有相反的作用。通过转化拟南芥发现,超表悬铃木SvP-like基因不仅延迟开花,还影响拟南芥的花器官发育,而将PlacSVP1超表转化矮牵牛仅影响花器官发育。4、根据转录组数据,克隆了 3个悬铃木FUL-like基因,其中PlacFL2的表达水平明显高于PlacFL1和PllacFL3,表达部位也更为广泛,它除在雌雄花序发育的过程中显著表达外,在各营养组织中也有表达。超量表达PlacFL1/2/3都明显促进拟南芥开花。推测PlacFL1和PlacFL3基因可能在成花转变和花序发育过程中起着重要的调控作用,而PlacFL2基因除此功能以外,在叶片以及营养芽的发育方面可能也具有重要作用。5、克隆得到5个悬铃木SEP-like基因,系统进化树分析结果表明,其中3个属于 SEP1/2/4 分支(分别命名为 PlacSEP1.1、PlacSEP1.2 和 PlacSEP1.3),2 个属于SEP3分支(命名为PlacSEP3.1和PlacSEP3.2)。除了 PlacSEP1.1/1.2,其他3个基因都从雌雄花序分化起始阶段开始表达,一直贯穿花序和果实发育的全过程,而PlacSEP1.2只在4月的雄花序中有表达。PlacSEP1.3和PacSEP3.1还在营养芽中有弱表达。35S:PlacSEP1.1/1.3/3.2转化拟南芥均导致明显早花,且35S:PlacSEP1.1/3.2转化体叶片卷曲,而35S:PlacSEP1.2/3.1转基因株系没有任何表型。酵母双杂结果显示,除了 3个PlacSEP1不能与PlacPI2a互作、PlacSEP3.1不能与PlacFL1/2互作以外,悬铃木 SEP-like 蛋白与 A、B、C、D 类蛋白(PlacFL1/2/3、PlacAP3、PlacPI2a、PlacAG和PlacSTK1/2)都存在互作,而且5个PlacSEP蛋白都能形成同源二聚体。6、克隆得到2个AGL6-like基因,分别命名为PlacAGL6a和PlacAGL6b,其表达规律非常相似,主要在花序分化和发育过程中表达,在果实发育过程中也有较低的表达,而在营养组织中无表达。PlacAGL6a/b在拟南芥中超量表达都导致其提前开花、叶片卷曲和分枝增多,但只有35S:PlacAGL6a转基因影响花器官的发育。另外,PlacAGL6a能形成同源二聚体,并且与C/D类蛋白(PlacAG、PlacSTK1/2)存在互作,而PlacAGL6b不能形成同源二聚体,与C/D类蛋白没有互作,说明它们在悬铃木开花调控过程中的功能可能既存在冗余又有分化。7、克隆了悬铃木UFO同源基因(PlacUFO)及其ATG上游3.3 kb启动子序列(ppPlcUFO,含5’ UTR)。LFY和UFO在悬铃木中的同源基因都只存在一个,PlacUFCO基因在悬铃木中的表达量非常低,且仅在幼年柄下芽、成花起始阶段的顶芽和柄下芽以及6月混合芽中有表达。通过PlacUFO的异位表达研究表明,PlacUFO对开花时间并没有影响,而是对叶片发育和花器官形成有明显影响。PlacLFY在拟南芥中超量表达促进开花,并且腋枝和侧序都转变为单朵花。酵母双杂研究发现,PlacLFY和PlacUFO没有互作,此特点不同于所有目前已有研究报道的物种。另外,通过对PlacLFY和PlacUFO启动子表达特性研究显示,pPlacUFO在转基因拟南芥中的表达活性主要存在于幼苗根、茎、叶的维管组织以及花瓣、雄蕊和柱头中,而pPlacLFY在拟南芥中的表达广泛存在。