siRNA沉默Pokemon基因抑制人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞的增殖

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背景:恶性淋巴瘤是一组高度异质性的淋巴造血系统恶性肿瘤,分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤两大类,在我国,非霍奇金淋巴瘤占恶性淋巴瘤的85%-90%。髓性致癌因子Pokemon,属于POK家族转录抑制因子。POK蛋白家族成员多表现出转录抑制效应,对肿瘤的发生发展起着重要的作用。研究发现,Pokemon是一种关键性致癌因子,在非小细胞肺癌、前列腺癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤中异常高表达,但是Pokemon在非霍奇金淋巴瘤中的研究较少。本研究前期结果显示,Pokemon蛋白在弥漫大B细胞淋巴瘤组织中表达上调。目的:采用Pokemon基因特异的siRNA重组慢病毒感染人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞,靶向沉默Raji细胞中Pokemon基因的表达,观察Raji细胞增殖活性的变化,并探讨其可能的分子机制。方法:1.构建靶向Pokemon基因的siRNA重组慢病毒载体并感染Raji细胞。2.采用实时定量PCR法和Western Blot法检测Raji细胞中Pokemon基因的沉默效果。3.采用流式细胞术检测沉默Pokemon基因后Raji细胞凋亡的情况4.在Raji细胞中沉默Pokemon基因后,采用实时定量PCR法和Western Blot法检测bcl-6和突变型p53表达水平的变化;结果:1.以重组慢病毒感染人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞,可获得较好的感染效果,感染效率均>90%。2.利用Pokemon靶向siRNA重组慢病毒载体能有效沉默Raji细胞中Pokemon基因表达,4个组中Pokemon基因的相对表达量分别为RNAi-R1组(0.48±0.04)、RNAi-R2组(0.10±0.02)、RNAi-R3组(0.31±0.04),(P<0.05);RNAi-R4组(0.86±0.11)(P>0.05)。3.在人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞中沉默Pokemon基因后,细胞凋亡率增高,各组细胞凋亡率分别为:空白对照组(5.63±0.21)%;阴性对照组(6.11±0.66)%;实验组(52.77±2.53)%(P<0.05)。4.在Raji细胞中沉默Pokemon基因的表达后,bcl-6基因和蛋白表达均显著降低,Western Blot法测得各组bcl-6蛋白的相对表达量分别为:空白对照组(1.00);阴性对照组(0.91±0.04); RNAi-Pokemon组(0.17±0.05)(P<0.05)。5.沉默Raji细胞中Pokemon基因的表达后,突变型p53基因和蛋白表达均显著降低,Western Blot法测得各组突变型p53蛋白的相对表达量分别为:空白对照组(1.00);阴性对照组(0.90±0.05); RNAi-Pokemon组(0.53±0.06)(P<0.05)。结论:1.Pokemon基因特异的siRNA重组慢病毒能有效的沉默人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞中Pokemon基因的表达;2.沉默Raji细胞中Pokemon基因的表达后细胞凋亡率显著升高;3.在Raji细胞中沉默Pokemon基因的表达可抑制bcl-6和突变型p53基因的表达;4.Pokemon基因在非霍奇金淋巴瘤的发生和发展中具有重要的作用,可作为非霍奇金淋巴瘤治疗潜在的新靶点。
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