研究目的和背景难治性、慢性创伤及组织缺损导致的疼痛、生理功能缺失、容貌的改变严重影响着病人的行动自由和生活质量,并进一步导致心理和社会问题。当自体及同种异体移植受来源、伦理及传染疾病等限制时,组织工程修复成为必然的选择。动物源性的异种生物材料是组织工程材料的研究热点,来源充分,安全可靠,是一种良好的再生组织材料支架,且没有异体生物材料移植的伦理学问题,便于进行规模化、产业化制备。其中猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)有着较低的免疫源性、良好的组织相容性且富含生长因子,是一种较为理想的生物源性材料。但SIS仍存在一下不足:首先SIS为薄膜状材料,缺乏足够的三维结构,限制了其应用领域;其次,SIS结构致密,缺乏疏松的孔径结构,不利于细胞的迁移爬行及营养物质的交换。本研究以SIS为原材料,通过一种新的交联改性方法,制备出了具有弹性形变能力和形态记忆功能的新型组织工程支架材料:SIS冷冻凝胶。通过扫描电镜观察其表面及内部的结构,了解其孔径大小。比较不同制备参数的冷冻凝胶吸水率、体外降解率、机械性能、细胞毒性,了解冷冻凝胶的形成机制,优选制备条件。通过体外细胞复合培养证实了SIS冷冻凝胶可主动吸附细胞。细胞能在支架材料上粘附生长。SIS冷冻凝胶的生物、物理性能良好,抗压能力强,不易碎裂,便于移植。是一种可用于细胞及药物移植的支架,在组织重建、创面修复及注射填充方面有广泛的应用前景。研究方法研究分四部分第一部分:脱细胞SIS膜的制备及扫描电镜观察1.采用机械刮除及甲醇/氯仿脱脂、胰酶消化、去垢剂漂洗相结合的办法制备脱细胞SIS膜。2.扫描电镜观察脱细胞SIS膜表面结构及有无细胞残留。第二部分:脱细胞SIS粉末的制备及SIS溶液浓度优选1.通过低温粉碎后胃蛋白酶消化、过滤、盐析、离心、透析、冻干等步骤制备脱细胞SIS粉末。2.观察不同浓度的SIS溶液性状及流动性,冻干制备的海绵形态,优选SIS溶液浓度。第三部分:SIS冷冻凝胶的制备及性能评价1.利用自制简易混匀装置,采用冷冻交联的方法制备了新型生物材料:具有弹性形变和形态记忆功能的SIS冷冻凝胶。2.扫描电镜观察SIS冷冻凝胶的微观结构及孔径大小。3.检测不同EDC浓度制备的冷冻凝胶吸水率、体外降解速率及机械性能。第四部分:SIS冷冻凝胶体外细胞复合培养1.分离培养新生GFP转基因小鼠皮肤成纤维细胞。2.体外复合培养后荧光显微镜及扫描电镜观察。3.以商品化胶原海绵为对照,CCK-8试剂盒检测不同EDC浓度制备的SIS冷冻凝胶细胞毒性。研究结果1.成功制备了脱细胞SIS膜,扫描电镜结果提示SIS表面纤维呈网状结构,未见明显残留细胞形态。2.脱细胞SIS粉末呈白色絮状。2mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml浓度的SIS粉末均可溶解于0.1%醋酸溶液中。SIS浓度越高,材料的形态及物理性能也越好。但SIS溶液变得越来越粘稠,流动性也越来越差。10mg/ml的浓度溶解已经变得较为困难。更高浓度的SIS溶液磁力搅拌器转子已经无法转动,溶液不均质,搅拌过程容易产生气泡。因此我们优选SIS溶液浓度为10mg/ml作为下一步实验参数。3.成功制备了具有弹性形变和形态记忆功能的SIS冷冻凝胶。压缩形变达85%以上时仍完好无损,移除外力后可迅速吸水复原。扫描电镜提示SIS冷冻凝胶呈多孔结构,孔径大小介于在50-200um之间。平均孔径大小为:(106.63±28.9)um。随着交联制备的EDC浓度升高,SIS冷冻凝胶吸水率不变、降解速率减缓、机械性能提高。优选EDC制备浓度为30m M-50m M。4.通过无菌纱布挤压排除并吸走内部的水分可使SIS冷冻凝胶变扁,滴加细胞悬液后可迅速主动回弹吸附细胞。GFP转基因小鼠成纤维细胞体外复合培养,荧光显微镜及扫描电镜结果均显示SIS冷冻凝胶有利于细胞的生长粘附,细胞存在与支架的表面及孔壁上,呈线性、纺锤形扁平结构。有大量伪足长出,部分融合成片。CCK-8试剂盒检测提示不同EDC浓度交联制备的SIS冷冻凝胶吸光度相同,与商品化胶原海绵支架材料无明显差异。结论1.通过自制简易混匀装置,利用水溶性零长度EDC交联剂,采用冷冻交联方法制备的SIS冷冻凝胶具有弹性形变和形态记忆功能,是一种可注射、可降解的支架材料。较目前国外所报道的冷冻凝胶制备方法更简便,交联条件更易控制,不需要接枝额外化学基团,避免了化工试剂的潜在生物毒性。2.SIS冷冻凝胶具有孔隙相通的多孔结构,有利于细胞的迁移爬行和营养物质的交换。不同EDC浓度制备的冷冻凝胶吸水率相同,体外降解速率、机械性能不同。优选EDC浓度为30m M-50m M。3.EDC浓度对SIS冷冻凝胶细胞毒性无影响。细胞可在支架表面及孔壁上粘附生长。