被子植物的受精被称为双受精,由来自同一个花粉粒的两个精细胞分别与卵细胞和中央细胞融合完成。卵细胞与一个精子结合形成二倍体的合子,是植物个体发育的起点,通过胚胎发生进而发育为胚,形成新一代孢子体。而中央细胞与一个精子融合形成三倍体的胚乳作为营养以及母体组织的媒介为胚的进一步发育提供保障。胚胎发生是高等植物发育过程中的重要事件,这一过程经历了一系列复杂而精巧的发育事态,多年来一直备受研究者关注。现有资料表明,胚胎发生发育的时间和空间的调控是非常精确的。体内正常的胚胎发生都有一个固定的发育模式,实际上是一系列基因的顺序表达及发育信号的有序转导的过程。合子是胚胎发育的原始细胞。因此,了解合子是如何启动胚胎发生形成原胚的分子机理是研究胚胎发育调控机理的重要切入点。早期胚胎发生中的一个重要事件是合子(受精卵)基因激活(ZGA, zygotic gene activation),合子基因激活标志着卵细胞发育由母体基因控制转换为合子基因控制(maternal-to-zygotic transition, MZT)。这种转变必然伴随着合子或幼胚的基因表达的改变,对早期胚胎发生产生深刻影响。本研究以子房培养系统、胚珠培养系统以及合子离体培养系统为基础,用RNA合成抑制剂对烟草合子进行处理,追踪观察合子基因激活受到阻碍后的发育事态。主要研究结果如下：1.通过人工授粉与固定分离胚囊的方法确定了相对准确的体内受精时间(约为授粉后48小时),作为为进一步工作前提条件。通过对固定分离胚囊与分离的生活状态合子的观察,确证烟草卵细胞在受精后发生体积缩小、定向伸长、极性重建等一系列细胞学上的变化是烟草合子阶段发育的重要特征。2.通过烟草胚珠培养系统与烟草叶肉原生质体培养系统,对三个转录抑制剂处理候选浓度进行了两步筛选,最终筛选出既能有效抑制细胞生长也能维持细胞活性的处理浓度。半定量RT-PCR对合子特异转录本的检测表明,转录抑制剂能够有效抑制这些转录本在处理组合子中的出现。3.改进了烟草子房半离体培养系统,既保证了高效率的胚胎发生又方便施加各种处理。在该系统基础上,对未受精子房进行转录抑制处理,达到对新转录本的完全抑制。研究母本物质对早期胚胎发育的作用以及新转录本产生的时间和作用。结果发现抑制剂处理后的烟草胚胎发育停止在早期合子阶段,不能进入分裂阶段,说明烟草中母体转录本仅能支持卵细胞受精后很短时间内的发育,MZT发生在一次分裂之前。4.为了进一步验证烟草未受精子房培养的结果,采用了烟草受精后子房(67HAP)培养来进一步进行转录抑制剂处理实验。对未受精子房培养抑制剂处理后,其合子发育停滞在相当于正常72HAP的发育阶段,推测合子基因激活在这个阶段业已开始。据此,确定了选择67HAP的子房与72HAP的合子进行培养,以便在后续实验中确认基因激活时间及其对合子发育的重要作用。对67HAP的子房培养中,对照组经过77小时的培养,达到144HAP时,胚胎已经发育到八到十六胞阶段；而抑制剂处理组,却呈现与未受精子房处理组相似的结果,发育停滞在合子阶段；在72HAP的合子离体培养中,对照组合子分裂频率接近50%,而在抑制剂处理后,所有合子都不能进行一次分裂。上述两方面结果表明,烟草合子基因激活确实发生在一次分裂之前,合子产生的新转录本对其进入一次分裂是必需的。5.基于烟草合子基因激活开始于合子分裂之前的认识,进一步对定向伸长已基本结束的96HAP合子进行了转录抑制处理,并同时辅以相应时期子房抑制剂处理试验,结果显示：抑制剂处理是离体培养的合子一次分裂比率有明显下降,但仍有近50%的二胞原胚出现,说明此时启动胚胎发生的新的转录本已经存在,并可以支持胚胎发生的起始；同样,相应时期(91HAP)子房培养也显示,在抑制剂存在情况下,胚胎可以发育到四细胞原胚阶段,同时对照已经达到八细胞胚阶段,说明合子基因激活起始于72HAP—96HAP,此间产生的新转录本足以支持合子发育至四细胞原胚。而对包含有二胞原胚的子房进行处理,胚胎则可以发育到八细胞阶段,表明新转录本的出现或其翻译是一个次第出现且连续出现的过程。6.转录抑制剂对不同时期合子的发育造成了不同的影响。对未受精的子房处理结果说明,它们仅能完成早期从卵细胞向合子的转变——卵细胞特征消失,表现为大液泡消失、细胞体积缩小、细胞核靠近细胞中部,但是胚胎发生过程却不能够启动,表现为合子不能够伸长,细胞壁的形成严重受阻,分裂不能够发生。而对72HAP合子的转录处理,使合子发育停止在相同阶段。说明母本物质仅能支持从卵细胞向合子转变卵细胞特征消失合子特征初步建立的过程,而进一步的合子定向伸长与初步的顶基极性建立则需要新转录本。而对母本向合子基因控制转换已经开始的合子进行转录抑制处理后,次分裂仍能够发生,说明母本向合子基因控制过程的开始也就意味着合子胚胎发生过程的起始,这时的合子虽然没有分裂但已经可被认为是一细胞的胚胎。但是在转录抑制后产生的二胞原胚中出现了一些特殊细胞学现象,较为明显的体现在细胞核的异常,说明此时虽然胚胎发生已经启动,但是胚胎进一步发育仍然需要新的转录本。7.转录抑制剂虽然明显阻碍了合子的发育过程,但是通过对处理组合子细胞的观察发现膜泡运输以及胞质环流都没有受到大的影响,说明处理组细胞维持了细胞活性。在42HAP子房培养中,经过一段时间处理(分别至96和120HAP)撤除抑制剂,胚珠仍表现出有限的生长,对其中所包含的合子观察发现有少部分合子发生了一定的生长,但是并没有进行分裂。表明合子基因激活和新转录本的出现有严格的时间进程,扰乱了这一进程可能难以恢复其固有的发育程序。