论文部分内容阅读
第一部分miR-152和miR-200s在IL-6诱导的肝胰岛素抵抗中的作用目的：胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要发病机制之一。microRNA是一簇长度约为20～24个核苷酸的单链非编码的小分子RNA。它们在转录后水平对下游靶基因进行调控。microRNA广泛表达于各种组织器官中,对组织器官的功能和发育具有重要的作用。microRNA参与糖尿病及其并发症的发生。它们调控胰岛素的合成、分泌、胰岛素信号通路和糖脂代谢等过程。目前,与肝胰岛素抵抗相关的microRNA报道尚少。研究证明miR-152和miR-200s与肿瘤的发生密切相关,但miR-152和miR-200s是否在肝胰岛素抵抗发生中起重要作用?目前尚不清楚。本研究通过建立IL-6诱导的胰岛素抵抗的细胞和动物模型,分析细胞或肝脏组织中miR-152和miR-200s的表达变化,探讨miR-152和miR-200s在IL-6诱导的肝胰岛素抵抗中的作用,明确miR-152和miR-200s调节PI3K/AKT信号通路的分子机制。方法：1.以12周龄db/db小鼠作为胰岛素抵抗模型小鼠,收集小鼠肝脏组织,用microRNA芯片分析肝脏中microRNA表达谱变化,并用Real-time PCR进一步验证芯片结果。2.10ng/mlIL-6处理小鼠肝细胞系NCTC1469和C57BL/6小鼠原代肝细胞24小时,建立胰岛素抵抗的细胞模型,检测PI3K/AKT信号和miR-152和miR-200s表达水平；在C57BL/6J小鼠背部皮下埋泵缓释注射IL-61周,建立IL-6诱导的胰岛素抵抗动物模型,观察肝脏中PI3K/AKT信号通路和miR-152和miR-200s表达水平。3.合成miR-152和miR-200s mimics和inhibitors,并转染入NCTC1469细胞,用Real-time PCR测定细胞中miR-152和miR-200s的水平,并且检测PI3K/AKT信号通路和糖原水平。4.用生物信息学方法预测miR-200s的下游靶基因；以Western blot分析miR-200s对下游基因FOG2和PTEN表达的影响。5.利用siRNA干扰FOG2和PTEN的表达,检测PI3K/AKT信号通路和糖原合成水平。结果：1.与对照组小鼠相比,12周龄db/db小鼠的体重、血糖、血脂和血清IL-6水平明显升高。在db/db小鼠肝脏中PI3K/AKT信号通路受到抑制,肝组织糖原含量显著降低。microRNA芯片结果显示,有31个microRNA表达升高,88个microRNA包括miR-152和miR-200s表达下降。进一步用Real-time PCR验证芯片的分析结果,结果显示,在db/db小鼠肝组织中miR-152和miR-200s水平显著低于对照小鼠。2. db/db小鼠体内是多因素集合体,无法确定究竟是何种因素导致miR-152和miR-200s表达的降低。因此,我们用10ng/ml IL-6处理小鼠肝细胞系NCTC1469和小鼠原代肝细胞,以确定IL-6与miR-152和miR-200s之间的关系。结果显示,在小鼠肝细胞系NCTC1469和小鼠原代肝细胞中,IL-6抑制PI3K/AKT信号通路和糖原合成,并降低miR-152和miR-200s的水平。皮下缓释注射IL-61周后C57BL/6J小鼠肝脏中PI3K/AKT信号通路和糖原合成受到抑制,miR-152和miR-200s水平也显著降低。3.为了确定miR-200s的下游靶基因,我们用生物信息学分析预测。结果显示,在FOG2和PTEN3’-UTR上均有miR-200s的结合位点。Western blot结果显示,miR-200s能够调控FOG2和PTEN的蛋白水平。4.进一步确定FOG2和PTEN对胰岛素信号通路和糖原合成的影响。在NCTC1469细胞中,利用siRNA干扰FOG2和PTEN的表达。结果显示,抑制FOG2和PTEN的表达可以逆转IL-6对PI3K/AKT信号通路和糖原合成的抑制作用。5.最后,为了明确miR-152对niR-200s的调控作用,我们在NCTC1469细胞中转染miR-152inhibitors, Real-time结果显示,抑制miR-152导致miR-200s的水平下降。结论：1.IL-6能够降低miR-152和miR-200s水平,抑制肝细胞PI3K/AKT信号通路和糖原合成。2.miR-152和miR-200s可以逆转IL-6对肝细胞PI3K/AKT信号通路和糖原合成的抑制作用。3. miR-200s通过下调FOG2和PTEN的表达而调控肝细胞PI3K/AKT信号通路和糖原合成。4.miR-152调节miR-200s的表达。第二部分三七总皂甙抑制apoE7-/-小鼠动脉粥样硬化的进展目的：动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一种慢性炎症性疾病。内皮细胞功能损伤和炎症反应是动脉粥样硬化的早期标志之一。三七总皂甙(Panax notogingseng saponins, PNS)具有抗氧化的特性,能够清除氧自由基,抑制粘附因子和细胞因子的表达。糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)参与了动脉粥样硬化早期斑块的形成。RAGE在维持慢性炎症和引起血管内皮细胞功能损伤过程中具有重要作用。目前研究报道,PNS能够抑制动脉粥样硬化进程,但是其分子机制尚未阐明。本研究用PNS处理apoE-/-小鼠,明确PNS对斑块大小和内容物的影响,揭示PNS通过抑制NF-κB活性和RAGE表达,降低粘附因子表达及下游信号通路,进而抑制动脉粥样硬化进程的分子机制。方法：1.以高脂饲料喂养20只10周龄雄性apoE-/-小鼠8周,建立动脉粥样硬化动物模型,同步给予PNS药物干预,以观察对动脉粥样硬化斑块形成的影响。收集外周血检测血糖、血脂水平。为了确定PNS的抗氧化作用,检测血清中MDA、SOD和GSH水平并用DHE染色法测定斑块内ROS的生成。2.用Movat染色观察头臂干和主动脉根部斑块大小；免疫组化法分析斑块内巨噬细胞、胶原成分和平滑肌细胞的含量。3.用Western blot分析动脉粥样硬化斑块中CD68、 Galectin-3、RAGE、p38MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB及其磷酸化水平以及下游的黏附趋化因子MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表达水平。结果：1.PNS对apoE-/-小鼠的血糖和血脂均无明显的影响。PNS处理4周后,明显降低apoE-/-小鼠血清中MDA水平,升高血清SOD和GSH水平,同时降低主动脉根部ROS水平。结果表明PNS具有显著的抗氧化作用。2. Movat染色结果显示,PNS可显著降低头臂干部位斑块的大小,而对主动脉根部斑块的大小没有明显的影响。免疫组化的结果显示,PNS处理后头臂干部位斑块内巨噬细胞含量减少,但胶原成分和平滑肌细胞含量没有明显变化。表明PNS抑制apoE-/-小鼠动脉粥样硬化的进展。3.提取整条降主动脉的蛋白,Western blot分析结果显示,PNS抑制NF-κB活性相关蛋白和RAGE的表达以及ERK1/2、p38MAPK、 JNK的磷酸化水平,降低VCAM-1、ICAM-1和MCP-1表达。结论：1.PNS可升高apoE-/-小鼠血清中SOD和GSH水平,有效地降低血清中MDA水平和动脉粥样硬化斑块内ROS的水平。表明PNS具有抗氧化作用。2.PNS能抑制NF-κB的活性。3.PNS可下调RAGE的表达。4.PNS通过抑制NF-κB活性和RAGE及其相关信号通路如JNK、ERK和p38信号通路蛋白的表达或激活,以抑制ICAM-1、VCAM-1和MCP-1等粘附因子表达,从而抑制动脉粥样硬化的进展。