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燕麦具有耐盐特性,但目前对燕麦耐盐性的研究主要集中在栽培耕作措施和生理生化两方面,对燕麦耐盐分子机制的研究还未见报道,对燕麦耐盐生理生化的研究也多关注某个生育时期的变化,尚未有对盐胁迫72h内燕麦的生理变化研究。本研究利用水培法研究盐胁迫下72h内燕麦的生理生化变化,为燕麦耐盐分子机理的研究提供生理参考依据;在没有燕麦基因组信息的条件下,利用Illumina高通量测序技术进行了转录组测序及不同盐胁迫时间的表达谱分析,得到了燕麦盐胁迫下的转录组及表达谱信息,比较分析了燕麦盐处理前后转录水平上的表达谱变化,以发现燕麦耐盐基因、揭示其耐盐机制;依据转录组与表达谱结果,以进一步明确盐胁迫下燕麦的生理响应与基因差异表达的关系。主要研究结果如下: 1.100mmol/L NaCl胁迫对燕麦的生理影响很小,250mmol/L NaCl胁迫时蒙农大燕1号脯氨酸含量、SOD酶活性增加量显著高于VAO-9,相对电导率、丙二醛与VAO-9相比差异不显著。300mmol/L NaCl胁迫72h,蒙农大燕1号的脯氨酸含量、SOD酶活性低于VAO-9,相对电导率、MDA含量的增加大于VAO-9。说明高盐胁迫下VAO-9的渗透调节及抗氧化能力高于蒙农大燕1号。 2.对盐胁迫前及不同盐胁迫时间的VAO-9混合RNA样品进行了转录组测序,结果得到65,424,436条clean reads,碱基总量约4.5G,经Trinity拼接组装得到平均长度为267 bp的contigs173,853条,进一步拼接组装得到65801条Unigenes,平均长度645bp。与NR、SwissPro、COG和GO等数据库比对后,发现燕麦叶片转录组中有大量响应盐胁迫、干旱胁迫、温度胁迫等逆境胁迫的基因以及许多功能未知的新基因。与KEGG比对分析,发现23652个Unigenes被注释到128条代谢途径,其中甘油磷脂代谢、植物激素信号转导、ABC转运,过氧化物酶、磷酸肌醇代谢、基础转录因子等代谢途径与燕麦抗逆性密切相关。 3.将燕麦未胁迫和胁迫处理的4个样品分别提取RNA后,建立测序文库并利用 Illumina测序,分析燕麦响应盐胁迫的表达谱特点。结果每个文库产生的 raw reads大于3.35 M,过滤后共得到13,709,388条clean reads。将各样品的clean reads分别与燕麦转录组比对(map),各样品tag map到基因的在2.2 M-2.7 M之间,占总tag数的72.96%-74.18%,map到基因组的tag数低于map到基因的。对250 mmol/L盐浓度下燕麦基因的表达模式分析发现,与对照相比,胁迫20min,429个基因上调表达,221个基因下调表达;胁迫3h,1130个基因上调表达,534个基因下调表达;胁迫24h,上调表达的基因达2068个,下调表达的有1163个。 4.为鉴定Illumina测序结果的准确性,挑选了有代表性的DGE分析中差异表达的14个基因进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。结果显示,在不同胁迫时间各基因的表达水平不同,但总体变化趋势与DGE分析结果相似,说明燕麦响应盐胁迫的数字基因表达谱分析结果准确可信,对分析中发现的在燕麦中差异表达的功能未知的基因可深入研究。 5.与相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量及 SOD酶活性变化相关的基因,差异表达变化趋势与生理指标的变化基本一致,说明基因差异表达量与生理反应密切相关,所以在同样的条件下,以上生理指标的变化可间接反应出耐盐基因的表达情况,可作为基因表达情况的生理验证依据。