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目的从不同表型滑膜巨噬细胞（synovial macrophages,SMs）表达差异与类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）疾病活动度相关性的角度,探讨芍药苷脂质体（paeoniflorinliposome,Pae-LS）治疗RA的作用机制。为进一步明确RA免疫治疗靶点及研发脂质体药物提供一定的参考依据。方法1.收集2016年1月至2020年12月中国人民解放军东部战区总医院有膝关节置换或滑膜切除术病史的RA和骨关节炎（osteoarthritis,OA）患者资料。对RA和OA患者滑膜组织进行免疫荧光双标记染色,运用荧光显微镜观察两种表型 SMs（CD68+iNOS+SMs 和 CD68+CD206+SMs）。采用 spearman 秩相关分析评估不同表型SMs与类风湿因子（rheumatoid factor,RF）、C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、血沉（erythrocyte sedimentation rate,ESR）以及改良疾病活动性标准（disease activity score 28,DAS28）-3评分的相关性;用受试者工作特征曲线评估SMs在RA疾病诊断和活动度评估方面的诊断效能。2.采用薄膜分散法制备叶酸和聚乙二醇共同修饰的Pae-LS。采用纳米粒度仪和激光粒度仪检测Pae-LS的粒径、分散指数和Zeta电位;高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）法检测 Pae 含量并计算 Pae-LS 的包封率和泄漏率;分别在pH 5.0、6.0和7.0条件下检测Pae-LS的药物释放率,评估Pae-LS的pH敏感性;于1、2、4、8、12、24、36、48和72 h不同时间点用HPLC法检测游离Pae含量并计算Pae-LS的体外释放率;在4℃、25℃和37℃条件下,72 h内不同时间点检测Pae-LS的粒径和多分散指数,评估Pae-LS的稳定性。Pae-LS处理小鼠巨噬细胞RAW 264.7后,采用MTT法检测巨噬细胞的活性情况,评估Pae-LS对巨噬细胞活性的影响。将12只SD大鼠随机分为Pae组（注射Pae溶液）和Pae-LS组（注射Pae-LS溶液）,采用液相色谱-质谱法分别检测不同时间点SD大鼠血浆药物浓度,评估脂质体是否延长药物在循环中的留置时间。3.体外实验中,采用流式细胞仪检测经脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）处理或未经LPS处理的RAW 264.7细胞对荧光剂香豆素-6（coumarin-6,Cou-6）和Cou-6-LS的摄取量;并用荧光显微镜观察其荧光值。将RAW 264.7细胞进行分组处理,组别一:Control组（未处理的RAW 264.7细胞）、LPS/γ-干扰素（γ-interferon,IFN-γ）组（用 LPS+IFN-γ 处理）、LPS/IFN-γ+Pae 组（LPS/IFN-γ预处理后用Pae干预）、LPS/IFN-γ+Pae-LS组（LPS/IFN-γ预处理后用Pae-LS干预）;组别二:LPS/IFN-γ 组（用 LPS+IFN-γ处理）、LPS/IFN-γ→白介素（interleukin,IL）-4 组（LPS+IFN-γ 处理后予 IL-4）、LPS/IFN-γ→IL-4+Pae 组（LPS+IFN-γ 处理后予 IL-4,再用 Pae 干预）、LPS/IFN-γ→IL-4+Pae-LS 组（LPS+IFN-γ 处理后予 IL-4,再用 Pae-LS 干预）。采用 RT-qPCR 和 Western Blot分别检测各组肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、IL-1β、IL-6 和IL-10的mRNA和蛋白表达,用RT-qPCR和流式细胞术分别检测巨噬细胞表面标志物CD68、CD206和iNOS的mRNA和蛋白表达。用Western Blot检测核因子-κB（nuclear factor-kappaB,NFκB）p65、IkappaB 激酶（IkappaBkinase,IKK）α、磷酸化信号转导与转录激活因子（phosphorylated signal transducer and activator of transcription,p-STAT）1 和 p-STAT6 的蛋白表达。4.体内实验中,建立胶原诱导性关节炎（collagen—induced arthritis,CIA）大鼠模型。将40只SD大鼠分组随机为5组:Normal组（SD大鼠注射生理盐水）、CIA组（CIA大鼠注射生理盐水）、CIA+LS组（CIA大鼠注射空白脂质体）、CIA+Pae组（CIA大鼠注射Pae溶液）、CIA+Pae-LS组（CIA大鼠注射Pae-LS溶液）。评估各组大鼠的关节炎指数、后爪关节肿胀程度、体重增长和组织病理损伤。分离踝关节滑膜组织巨噬细胞,采用RT-qPCR和Western Blot检测TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 mRNA和蛋白表达;流式细胞术检测CD68、CD206和iNOS蛋白表达;Western Blot检测NFκB p65、IKKα、p-STAT1和p-STAT6的蛋白表达。结果1.RA 患者滑膜组织中的 CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs 和CD68+iNOS+SMs水平高于OA患者,而CD68+CD206+SMs数目明显低于OA患者,且差异具有统计学意义（P＜0.01）。相较于RA缓解组,RA活动组患者滑膜组织中 CD68+iNOS+SMs和 CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs 水平明显增高（P＜0.01）。CD68+iNOS+SMs 数量与 RF、CRP、ESR 和 DAS28-3 评分呈正相关（P＜0.01）,CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs 比值与 RF（P＜0.05）、CRP（P＜0.01）、ESR（P＜0.01）和 DAS28-3 评分（P＜0.01）也呈正相关,而CD68+CD206+SMs 数量与 CRP、ESR 和 DAS28-3 评分呈负相关（P＜0.01）。此外,CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs 比值在RA疾病诊断中具有较高的敏感度和特异度（AUC:0.973,敏感度95.8%,特异度98%）,而CD68+iNOS+SMs数量在RA疾病活动度评估中具有更高的敏感度和特异度（AUC:0.953,敏感度 82.5%,特异度 87.5%）。2.制备的Pae-LS呈圆球状,平均粒径为228.92 nm,多分散指数为0.148,Zeta电位为-26.82 mV。其包封率为52.88±3.12%,4℃下泄露率为5.27±0.38%,在常温条件下泄露率为13.05±0.38%。pH 5.0条件下Pae释放率为76.00±4.58%,pH 6.0 条件下 Pae释放率 64.04±4.14%,pH 7.0条件下 Pae释放率为 54.01±3.90%。体内释放试验显示,随着时间的延长药物释放率逐渐增多,但36 h后释放率处于稳定状态。72 h内脂质体的粒径和多分散指数变化不显著。与未经Pae-LS处理的RAW 264.7巨噬细胞相比,Pae-LS处理的巨噬细胞活性没有显著变化（P＞0.05）。Pae-LS处理的SD大鼠Pae血浆浓度在30 min后约为游离Pae处理的两倍（P＜0.05）,并在3h后仍维持在一定水平。3.体外实验中,相较于游离Cou-6,Cou-6-LS处理LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞后摄取量和荧光值明显增高（P＜0.01）。与LPS/IFN-γ组比较,LPS/IFN-γ+Pae组中TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达显著降低（P＜0.01）,IL-1β mRNA（P＜0.01）和 IL-1β 蛋白（P＜0.05）表达减少,IL-10 mRNA（P＜0.05）和IL-10蛋白（P＜0.01）表达升高,细胞表面标志物iNOS mRNA水平降低而 CD206 mRNA 表达增高（P＜0.01）,转录因子 NFκB p65、IKKα、p-STAT1蛋白表达下降而p-STAT6蛋白表达增高（P＜0.01）。与LPS/IFN-γ组相比,LPS/IFN-γ+Pae-LS 组中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 mRNA 和蛋白表达显著下调（P＜0.01）,IL-10 mRNA和蛋白的表达明显上调（P＜0.01）,iNOS mRNA水平明显降低而 CD206mRNA 表达显著增高（P＜0.01）,NFκB p65、IKKα、p-STAT1蛋白表达显著下降而p-STAT6蛋白表达明显增高（P＜0.01）。相较于LPS/IFN-γ+Pae组,LPS/IFN-γ+Pae-LS组中TNF-α mRNA和蛋白表达降低更明显（P＜0.01）,IL-1β mRNA（P＜0.01）和 IL-1β 蛋白（P＜0.05）水平更低,IL-6 mRNA（P＜0.05）和 IL-6 蛋白（P＜0.01）表达下降更显著,IL-10 mRNA（P＜0.01）和 IL-10蛋白（P＜0.05）水平更高,iNOS mRNA水平降低和CD206 mRNA表达增高更加显著（P＜0.01）,NFκB p65（P＜0.05）,p-STAT1（P＜0.01）和 IKKα（P＜0.01）蛋白表达下调得更多,p-STAT6蛋白表达增高得更显著（P＜0.01）。与LPS/IFN-γ→IL-4 组比较,LPS/IFN-γ→IL-4+Pae 组中 TNF-α、IL-1 β 和 IL-6 mRNA和蛋白水平显著降低（P＜0.01）,IL-10 mRNA（P＜0.05）和IL-10蛋白（P＜0.01）表达升高,iNOS mRNA表达下降而CD206 mRNA表达增高（P＜0.01）,NFκB p65（P＜0.01）、p-STAT1（P＜0.05）和 IKKα（P＜0.01）蛋白水平下降而 p-STAT6蛋白表达明显增高（P＜0.01）。与 LPS/IFN-γ→IL-4 组比较,LPS/IFN-γ→IL-4+Pae-LS 组中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 mRNA 和蛋白水平显著减少（P＜0.01）,IL-10 mRNA和蛋白表达明显升高（P＜0.01）,iNOS mRNA表达降低而 CD206 mRNA 表达上调（P＜0.01）,NFκB p65、p-STAT1 和 IKKα 蛋白水平下降（P＜0.01）而p-STAT6蛋白表达明显增高（P＜0.01）。相较于LPS/IFN-γ→IL-4+Pae 组,LPS/IFN-γ→IL-4+Pae-LS 组中 TNF-α mRNA（P＜0.05）和TNF-α蛋白（P＜0.01）水平更低,IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白表达降低更显著（P＜0.01）,IL-10 mRNA（P＜0.05）和 IL-10 蛋白（P＜0.01）表达更高,iNOS mRNA表达降低和CD206 mRNA表达增高得更显著（P＜0.01）,p-STAT1（P＜0.01）、NFκB p65（P＜0.01）和IKKα（P＜0.05）蛋白表达降低更明显,p-STAT6蛋白表达上调更显著（P＜0.01）。4.体内实验中,与CIA组比较,CIA+LS组中大鼠体重、后爪肿胀程度和关节炎指数无明显变化（P＞0.05）。在治疗第20d,相较于CIA组,CIA+Pae组和CIA+Pae-LS组中大鼠的体重明显增长（P＜0.01）,而后爪肿胀程度和关节炎指数明显下降（P＜0.01）。与CIA+Pae组比较,CIA+Pae-LS组的大鼠体重增加更为显著（P＜0.05）,后爪肿胀程度减轻更明显（P＜0.01）,关节炎指数下降得更多（P＜0.05）。相较于CIA组,CIA+Pae组和CIA+Pae-LS组中大鼠踝关节组织的病理评分均明显降低（P＜0.01）,且CIA+Pae-LS组的效果优于CIA+P ae组（P＜0.01）。相较于 CIA 组,CIA+Pae 组和 CIA+Pae-LS 组的 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 mRNA和蛋白表达下降而IL-10 mRNA和蛋白表达增高（P＜0.01）,CD68与CD206共表达增加而CD68和iNOS共表达降低（P＜0.01）,NFκB p65、IKKα、p-STAT1蛋白表达下调而p-STAT6蛋白表达上调（P＜0.01）,且Pae-LS疗效显著优于游离Pae（P＜0.01）。结论1.RA患者滑膜组织中以CD68+iNOS+SMs居多,CD68+iNOS+SMs数目和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs 比值与RA疾病活动性呈正相关,有望成为疾病诊断和疾病活动性评估方面的新指标。2.Pae-LS能够通过NFκB和STAT信号通路抑制M1巨噬细胞极化和促进M2表型极化,从而减轻RA滑膜炎症,下调炎性细胞因子表达和诱导抗炎细胞因子分泌,可能成为治疗RA的候选药物。