α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosida）作为一种糖苷水解酶,可以水解含鼠李糖的类黄酮化合物中的糖苷键,增加此类化合物的水溶性和生理活性,因此在医药、食品和化妆品等领域具有重要的应用价值。黑曲霉是一类常用的产α-L-鼠李糖苷酶菌株,但大部分野生黑曲霉在产α-L-鼠李糖苷酶的同时还产β-葡萄糖苷酶,这不仅加大酶分离纯化的难度,而且还会干扰酶的应用研究。通过基因工程技术,可以得到只产α-L-鼠李糖苷酶的工程菌。本课题组通过前期实验,构建筛选到多株含α-L-鼠李糖苷酶编码蛋白基因的毕赤酵母工程菌株。本论文在此基础上进一步筛选得到一株高产α-L-鼠李糖苷酶的工程菌N12,并对其产酶条件、分离纯化方法、酶学性质、应用和固定化进行了研究。主要研究内容和结果如下:1、对前期得到的11株含α-L-鼠李糖苷酶编码基因的毕赤酵母工程菌,在相同发酵条件下诱导表达α-L-鼠李糖苷酶,从中筛选出表达量最高的菌株N12,用于后续研究。通过探究不同的接种量和发酵时间对酶活性的影响,来优化重组毕赤酵母工程菌的发酵条件。结果表明,发酵液初始OD值为1时,诱导发酵时间为7d,发酵得到酶活性最高,为3250 U/m L。2、对重组α-L-鼠李糖苷酶N12-Rha进行了分离纯化,并采用SDS-PAGE电泳测定其分子量大小。结果表明,经镍柱纯化后所得酶的分子量大小约为97KD。用N-糖苷酶F消化纯化后的酶,测得去糖肽后的N12-Rha大小约为70 KD,这与采用计算机模拟计算的蛋白分子量大小一致。通过超滤浓缩法,可将粗酶液浓缩50-100倍,浓缩后的酶溶液经冷冻干燥制作成高活性的酶粉,便于运输和保存。3、N12-Rha的最适反应温度为50℃,最适反应p H为4.8;在60℃以下,能够保持稳定酶活,具有一定的耐热性,在p H值为3-6时,能够保持稳定酶活,具有一定耐酸性。N12-Rha能够水解柚皮苷、芦丁、橙皮苷和新橙皮苷,不能水解杨梅苷和淫羊藿苷。以不同浓度的芦丁溶液为底物,计算出酶的Vmax的值为1.316m M/L·min,Km为6.765mmol/L。添加1 m M,10 m M,50 m M,100 m M和150 m M Mg2+,Fe3+,Fe2+和Zn2+可以增加酶活性;浓度为1 m M,10 m M,50 m M,100 m M和150 m M的Ba2+对酶活性具有一定的抑制作用。EDTA和β-ME对酶活性几乎没有影响,高浓度的DTT对酶活有一定影响,SDS可以抑制酶活性。4、将N12-Rha分别对新橙皮苷、橙皮苷、芦丁和柚皮苷进行水解,探究酶对含不同糖苷键的类黄酮化合物的水解能力大小及水解产率。结果表明,同一条件下的N12-Rha水解新橙皮苷能力大于橙皮苷。经计算,可知新橙皮苷和橙皮苷水解成橙皮素7-O-葡萄糖苷的产率分别为:94.5、93.9%。N12-Rha水解芦丁能力大于柚皮苷。经计算,芦丁和柚皮苷水解成异槲皮素和普鲁宁的产率分别为93.6%、91.2%。5、采用包埋法,对N12-Rha进行固定化研究,确定了最佳固定化材料的配比为3%的壳聚糖溶液和8%的聚乙烯醇溶液;戊二醛的最佳浓度为2%,最佳活化时间2h,最佳交联时间24h。固定化酶最适反应温度为60℃、稳定温度为30-80℃、最适反应p H为5、稳定p H为3-8。固定化酶的耐酸碱和热稳定性与游离酶相比都有一定的提升。此外固定化酶在经过多次的水解反应后,还能保持相对高的酶活,能反复使用。