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克氏原螯虾（Procambarus clarkii）,俗称小龙虾,是我国重要淡水经济虾类之一,其生殖方式为受激素调节的有性生殖。胰岛素样促雄性腺激素（insulin-like androgenic gland,IAG）是一种由甲壳动物促雄性腺（androgenic gland,AG）分泌的激素,为甲壳动物特有,主要具有调节性别分化的功能。胰岛素样促雄腺激素基因（insulin-like androgenic gland gene,IAG）作为控制该激素分泌的重要基因已在多种虾蟹类中发现。本研究以克氏原螯虾为研究对象,采用反向遗传学技术RNA干扰（RNA interference,RNAi）,体式显微镜观察法,组织切片技术,实时荧光定量PCR方法,研究了克氏原螯虾IAG基因的性别调控功能,为揭示克氏原螯虾性别分化和性别控制原理提供理论基础,为将来实现克氏原螯虾单性化养殖提供理论依据。主要研究结果如下:1.将出膜后7d至12d的幼虾根据第一腹肢的形态进行分型:N（None）型,第一腹节处平滑,没有出现生殖肢原基;R（Round）型,第一腹节处出现明显圆形凸起,出现生殖肢原基;T（Tiny）型,第一腹节处出现微小褶皱式凸起,出现生殖肢原基。连续跟踪观察6d后发现R型腹肢发育最快,T型其次,N型最慢。12d后R型和T型发育出明显生殖肢原基,而N型在出膜30d后才出现生殖肢原基。随后R型和T型被鉴定为雄性,N型可能为雌性也可能为雄性。该方法鉴定克氏原螯虾雄幼虾的准确率为100%。对幼虾头胸部进行石蜡纵切染色后观察发现雌雄克氏原螯虾幼虾在出膜7d后的内部器官没有明显差异,原始性腺虽然已经出现,但是还未分化。2.为了研究IAG基因在克氏原螯虾性别决定和性别分化中起到的作用,本试验建立了dsRNA（Double-strand RNA）和siRNA（Small interference RNA）两种药物干扰克氏原螯虾IAG基因的方法,并对该方法进行优化。对qPCR引物进行退火温度优化后发现引物IAG1的最适退火温度为57.8℃,引物β-actin1的最适退火温度为62.2℃。QPCR结果显示:siRNAs候选序列中0.5μg/g weight和1μg/g weight的siRNA3极显著抑制IAG基因在精巢中的表达,持续时间为120h,其他候选序列均不具有沉默效应。与之类似,0.5μg/g weight和1μg/g weight的dsRNA极显著抑制IAG基因在精巢中的表达,持续时间为168h。以上结果表明siRNAs相较于具有更多靶位点的dsRNA不易产生沉默效应,且在持续时间上siRNA显著短于dsRNA。除了合理的序列设计之外,克氏原螯虾IAG基因沉默依赖高剂量的干扰药物,在本实验中为0.5μg/g weight和1μg/g weight。3.使用两种RNA干扰药物分别对克氏原螯虾幼虾和成虾的IAG基因进行干扰,比较两种药物在不同时期克氏原螯虾中的沉默效果,得出以下结论:在克氏原螯虾成虾中的干扰结果显示dsRNA比siRNA具有更长的效应时间,且在五种组织中都具有干扰效果。RNA干扰24h后,与对照组相比,dsRNA组和siRNA组的输精管中精子数量大量减少,精巢中充斥大量次级精母细胞和精子。以上结果表明RNA干扰药物可以广泛地在克氏原螯虾各组织中实现沉默效应,在性腺相关组织中IAG基因的沉默会导致精原细胞和精子的发生受阻。在克氏原螯虾幼虾中的干扰结果显示长期干扰会造成极高的死亡率,从第二次干扰注射后,dsRNA开始具有显著干扰效果。从第三次注射开始,两种药物都产生了极显著的沉默效果,并且随着每一次注射,IAG基因始终处于极低的表达量水平。dsRNA处理组的雄幼虾第一腹肢出现畸形,肝脏出现明显病变,表现为大量空泡化结构。根据以上结果推测,RNA干扰药物对肝脏造成较大代谢负担,破坏其代谢功能导致虾的死亡。第一腹肢出现畸形则表明克氏原螯虾IAG基因不仅影响第一性征的形成,还影响着第二性征的发育。