研究背景微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是近年来在真核生物中发现的一类内源性具有调控功能的单链非编码RNA,其长度约为19-25个核苷酸,主要发挥基因转录后水平调控作用。目前已有研究证明,miRNA参与生命过程中的一系列重要活动,包括生长发育、免疫防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、肿瘤发展、心脏发生等。虽然目前对已发现的miRNA分子功能和作用靶基因的研究还处于初步阶段,但是从miRNA在不同组织和疾病的表达谱中分析发现,某些miRNA在特定疾病中具有明显的组织特异性。以上研究均表明,miRNA在疾病发生发展过程中存在非常重要的作用。miRNA的发现是临床分子生物学革命性的突破,其高度的特异性和稳定性决定了其作为一种新的疾病生物标志物的巨大潜力。因此,找到一种适合的检测方法显得尤为重要。目前,检测miRNA的常见方法包括印迹杂交、基因芯片、原位杂交以及荧光定量PCR。这些技术多需要复杂的步骤、昂贵的仪器以及较高的实验成本,在一定程度上限制了其临床应用。若发展一种适用于临床实验室的miRNA检测方法,应满足以下几点要求：一.具备敏感的检测能力,能定量检测出极低丰度的不同临床标本中的miRNA;二.具备良好的特异性,能区分出高度同源的miRNA;三.检测过程相对简便,无需昂贵的设备和试剂。近年新发展起来的核酸链置换等温扩增技术,无论是在实际操作还是仪器要求方面,都比目前常用技术更为简单方便,它摆脱了对精良设备的依赖,在临床基层和现场快速诊断中均显示了良好的应用前景。链置换等温扩增反应是指某些具有链置换活性的DNA聚合酶在延伸新链的过程中遇到下游DNA链,可以继续延伸并同时将下游双链剥离而产生游离的单链,其不需要特异性识别位点而在miRNA传感器设计中得到广泛应用。然而,目前等温扩增多需要光学检测,此过程需要激发光源,可能会造成背景光的干扰,且荧光在外界环境易淬灭,再者单一的光学检测法本身灵敏度有限,并不适合临床特别是基层医院的广泛应用。如何解决这些不足,成为等温扩增领域的一个关键问题。生物传感器由于集高效、灵敏、特异、小巧、经济等优点于一身,目前也已成为生命科学领域的研究热点。与光学检测方法相比,电化学传感技术具有易微型化、选择性好、背景值低、无荧光淬灭、成本低、样品消耗少、便于实现自动化等优点在核酸检测方面具有独特的优势,且有效弥补了光学检测法的不足。然而,传统的电化学传感器多利用信号放大提高灵敏度,由于中间没有涉及到扩增反应,多数方法并不能达到临床实际样本的检测要求。如何进一步提高灵敏度,成为电化学传感技术领域的一个关键问题。综上所述,链置换等温扩增反应能够对核酸进行数量扩增增加方法的灵敏度,电化学传感技术能有效的弥补等温扩增光学检测易淬灭背景高等方面的不足,且能通过信号放大进一步增加方法的灵敏度。基于此,我们提出了一个方案,链置换等温扩增与电化学传感联用检测miRNA。该方案利用磁性纳米粒子作为液相检测的微载体,通过在微载体上绑定具有茎环状结构的探针,当体系中的靶miRNA与微载体上的探针结合后,探针打开。此时,引物与聚合酶顺利连接到探针上,在dNTP存在的条件下发生延伸反应,生物素标记的dCTP连接到双链DNA上,而被置换下来的靶miRNA与另一条探针结合,启动新一轮循环。待反应一段时间后,终止等温扩增反应。随后,添加链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(streptavidin-alkaline phosphatase, Sa-ALP),通过磁性分离从而在磁性微粒上标记有大量的酶,酶促产物抗坏血酸(L-ascorbic acid, AA)在电极上被氧化为脱氢抗坏血酸,产生可被检测出的氧化峰电流。研究目的链置换等温扩增技术、电化学传感技术联用建立一种快速、高效、特异且操作简单的miRNA检测方法,并对该方法进行方法学评价。完成一定样本量的组织miRNA检测并进行初步临床应用评价,为miRNA电化学检测提供新思路。研究方法1.链置换等温扩增-电化学联用体系可行性探讨1.1采用Beacon designer软件对靶序列(目前暂定miR-21)设计特异型茎环状结构探针,琼脂糖凝胶电泳筛选与靶miRNA标准品特异结合的探针。1.2构建链置换等温扩增体系,测其荧光验证等温扩增反应是否能够顺利进行。1.3根据生物配体的氨羧络合反应将氨基修饰的寡核苷酸探针(捕获探针)固定在羧基修饰的磁珠表面,对液相等温扩增体系进行共聚焦表征观察探针是否顺利连接到纳米磁珠表面。1.4利用循环伏安法(cyclic voltammetry, CV)对各个步骤的纳米磁珠进行表征。1.5将生物素化的dCTP掺和至等温扩增反应产物,探讨生物素化dCTP对等温扩增反应的影响。琼脂糖凝胶电泳对等温扩增产物进行分离、鉴定,并选择理想biotin-dCTP的添加比例。2.基于链置换等温扩增／酶促电化学的miRNA基因传感器体系构建及其方法学初步评价2.1比较不同探针浓度、酶量、稀释比、孵育时间等条件下,所产生电信号的变化,优化出最佳反应条件。2.2在此反应条件下,通过对液相中标准品miRNA的实时监测,深入解析液相中生物分子反应时传感器的响应机制,计算出一系列杂交动力学常数,通过传感器等效电路分析法建立数学模型。2.3验证该基因传感器鉴定错配的能力。2.4以目前miRNA检测常用方法——荧光定量PCR为参考方法,对其进行临床应用初步评价。实验结果1.合成并纯化针对miR-21特异序列的氨基修饰的茎环状探针,用琼脂糖凝胶电泳验证了其特异性。多功能酶标仪荧光图验证了在phi29DNA聚合酶的参与下链置换等温扩增反应得以顺利进行。空白磁性微载体(magnetic microcarrier, MMC)与磁性微载体-茎环状探针(magnetic microcarrier- molecular beacon, MMC-MB)的激光共聚焦荧光结果证明了经氨羧络合反应探针能顺利连接到磁珠表面。CV结果表明随着反应的不断进行,纳米粒子表面不断连接上新的物质。最后,又通过掺入不同比例的生物素成功验证了生物素掺入法虽影响反应速率,但不影响反应顺利进行。2.在本文第一部分成功验证了构建方法关键步骤可行性的基础上,通过条件优化测得miRNA电化学基因传感体系在miRNA目的序列浓度为10-14M-10-8M范围内,氧化峰电流改变值与miR-21浓度的对数呈线性关系,该方法检测限为9fM,并证实了其能够在电化学平台上实现对目的序列的特异性识别,且能够区分一个碱基的差异。最后,利用本方法检测组织中miR-21的表达量,其结果与荧光定量PCR结果具有良好的一致性,初步验证了该方法的检测效能。结论链置换等温扩增技术-酶促反应电化学传感器联用构建核酸多酶标记体系,分别从数量扩增、放大电流信号两方面增加分析的灵敏度。该方法不需逆转录,检测时间短,不需大型仪器,适用于临床特别是基层医院广泛开展。该方法具有较高特异性与灵敏度(检测限9fM),在低水平miRNA的检测以及电化学芯片的研制方面具有一定理论意义和潜在的实际应用价值。通过检测临床组织样本miRNA,验证了该方法的检测效能,为构建一种高敏、快速、经济、简便的电化学miRNA检测技术提供新的实验基础。