自交不亲和是显花植物在长期自然进化过程中形成的一种广泛存在的生殖隔离机制,它使雌蕊能够拒绝自我花粉的生长。S-RNase介导的配子体自交不亲和是花粉管受到抑制导致不能顺利延伸到子房而完成授粉受精过程,主要由花柱决定子S-RNase和花粉决定子SLF/SFB控制,还有S位点之外的基因参与植物的自交不亲和。为了进一步探索自交不亲和机制,本文以自交不亲和草莓—绿色草莓的自交二代株系Ls-S2-49（SaSa）作为实验材料,构建酵母双杂交花粉cDNA文库,筛选出可能参与自交不亲和的非S基因。将阳性克隆进行进一步的研究,利用Sb-RNase验证其是否具有S-RNase单元型特异性;通过qRT-PCR技术分析互作基因在绿色草莓不同组织的特异性表达,以及自花授粉后不同时期花柱中的表达情况;并且利用生物信息学对其序列做进一步的分析。主要结果如下:1.Ls-S2-49株系异花授粉能够正常结实,自花授粉表现自交不亲和性,且自花授粉24 h时花粉管基本停止生长。构建绿色草莓花粉cDNA文库是利用酵母双杂交技术研究蛋白互作的基础。利用CTAB法提取花粉管RNA,通过gateway技术构建花粉cDNA文库。结果表明,提取的总RNA完整性较好、纯度高,利用gateway技术构建的cDNA文库,其库容量达到1.2×107CFU,文库具有较高的覆盖度,重组率和完整性,构建的花粉cDNA文库符合标准。2.以表达载体pGBKT7-Sa为诱饵质粒筛选绿色草莓花粉管酵母cDNA文库,将共转化酵母菌涂布于 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 筛选培养基,并用SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal培养基做进一步验证。结果表明:诱饵表达质粒pGBKT7-Sa没有毒性,没有自激活现象,可以作为酵母双杂交试验的诱饵载体。获得6个互作蛋白,分别为类半胱氨酸蛋白酶RD21a-like、富含脯氨酸的蛋白PRP2-like、一个未知蛋白UN、含AT结构域的蛋白AT、细胞数调节器CNR8和天冬氨酸蛋白酶/L-天冬酰胺酶ASP。3.以Sb-RNase验证筛选出来的6种蛋白与S-RNase的互作是否存在单元型特异性;结果显示这6种蛋白与Sb-RNase也是互作的,不存在S-RNase单元型特异性,可能在自交不亲和反应中起作用调节通用代谢途径。为了明确6种互作子蛋白作用部位,选择叶片、茎、花萼、花瓣、花粉和花柱进行组织特异性表达分析;结果显示6种互作子在叶片、茎、花萼、花瓣、花粉和花柱中皆可表达,但花粉中的表达量最高。为了分析互作子在绿色草莓GSI反应中可能发挥的功能,以授粉后0h的花柱为参考,选择6 h、12 h、24 h、48 h和72 h的花柱进行基因时空表达分析;6种互作子基因与S-RNase表达趋势相一致,呈先上升后下降的趋势,在授粉后12h达到峰值。为了进一步了解互作子功能,对其进行基础的生物信息分析。结果显示RD21a-like可能参与生长发育,种子萌发,环境胁迫以及细胞程序性死亡,还与花粉的发育、萌发和花粉管的生长有关;PRP2-like与未知蛋白通过影响细胞壁的正常发育来控制花粉的萌发和花粉管的生长;AT蛋白与花粉萌发相关;CNR8可能通过抑制花粉管的生长参与自交不亲和;ASP可能基础代谢途径提供底物。