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第一部分ciRS-7在食管鳞状细胞癌组织和细胞中的表达及对其生物学行为的影响目的:研究环状RNA ciRS-7在食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)组织和细胞中的表达及其对ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:1.采用RT-PCR和qRT-PCR法检测ciRS-7在ESCC组织和细胞中的表达。2.采用Sanger测序鉴定ciRS-7的环化剪接点序列。3.RNase R实验验证ciRS-7在ESCC细胞中的特性。4.采用CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕愈合实验以及Transwell实验检测过表达或敲低ciRS-7对ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:1.RT-PCR结果显示,以ESCC组织和细胞的cDNA和gDNA为模板,环状转录本只能通过发散引物在cDNA中扩增出来,而线性转录本可通过聚合引物同时在cDNA和gDNA中扩增出来。qRT-PCR结果显示,与癌旁正常组织相比,ESCC组织中ciRS-7表达水平显著上调(P<0.05)。2.PCR产物的Sanger测序结果验证了ciRS-7的环化剪接点序列。3.RNase R实验结果显示,ciRS-7比其相应的线性转录本更能耐受RNase R的消化作用(P<0.05)。4.CCK-8实验和平板克隆形成实验结果显示,过表达ciRS-7可增强TE13细胞的增殖能力(P<0.05);而敲低ciRS-7可抑制TE1细胞的增殖能力(P<0.05)。划痕愈合实验和Transwell实验结果显示,过表达ciRS-7可增强TE13细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05);而敲低ciRS-7可抑制TE1细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。小结:1.ESCC患者肿瘤组织中ciRS-7的表达明显高于癌旁正常组织,而且ciRS-7的表达水平与患者的病理分级和临床分期显著相关。2.过表达ciRS-7能增强ESCC细胞的增殖,迁移和侵袭能力;敲低ciRS-7能抑制ESCC细胞的增殖,迁移和侵袭能力。第二部分ciRS-7在食管鳞状细胞癌中对肿瘤抗原MAGE-A家族表达调控机制的研究目的:探讨ciRS-7通过作为miRNA的分子海绵调控其下游靶基因MAGE-A家族的表达进而揭示ciRS-7在ESCC中发挥促癌作用的可能机制。方法:1.通过StarBase和CircNet在线数据库预测可能与ciRS-7相互作用的miRNA分子及其结合位点。2.采用RIP实验和双荧光素酶报告基因实验验证ciRS-7是否能与miR-876-5p相互作用。3.采用CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕愈合实验以及Transwell实验检测过表达或敲低miR-876-5p对ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。4.通过挽救实验检测过表达ciRS-7和miR-876-5p对ESCC细胞增殖,迁移和侵袭能力的影响。5.通过TargetScan在线数据库预测miR-876-5p下游的靶基因。6.采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-876-5p是否能与MAGEA基因相互作用。7.采用qRT-PCR检测ESCC细胞中过表达miR-876-5p和ciRS-7后MAGE-A mRNA的表达变化。8.采用Western blot实验检测ESCC细胞中过表达miR-876-5p和ciRS-7后MAGE-A蛋白的表达变化。9.采用CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕愈合实验以及Transwell实验检测敲低MAGE-A基因对TE1细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。10.采用免疫组织化学染色法检测112例原发性ESCC组织,244例淋巴结组织和26例远处转移组织中MAGE-A蛋白的表达情况。结果:1.StarBase在线数据库分析结果显示,ciRS-7和miR-876-5p存在多个结合位点。CircNet在线数据库预测结果显示,ciRS-7可能作为miR-876-5p的分子海绵。2.RIP实验和双荧光素酶报告基因实验结果显示,ciRS-7在ESCC细胞中能与miR-876-5p相互作用(P<0.05)。3.CCK-8实验和平板克隆形成实验结果显示,过表达miR-876-5p可抑制TE1细胞的增殖能力(P<0.05);而敲低miR-876-5p可增强Eca109细胞的增殖能力(P<0.05)。划痕愈合实验和Transwell实验结果显示,过表达miR-876-5p可抑制TE1细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05);而敲低miR-876-5p可增强Eca109细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。4.挽救实验结果显示,过表达ciRS-7可增强ESCC细胞的增殖,迁移和侵袭能力(P<0.05),而补充上miR-876-5p后可部分缓解过表达ciRS-7引起的ESCC细胞增殖,迁移和侵袭能力的升高(P<0.05)。5.TargetScan在线数据库预测结果显示,miR-876-5p与肿瘤抗原MAGE-A家族的多个成员3’UTR存在结合位点。6.双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-876-5p能与肿瘤抗原MAGE-A家族的多个成员相互作用(P<0.05)。7.qRT-PCR结果显示,过表达miR-876-5p后TE1和KYSE30细胞中MAGE-A mRNA的表达水平明显降低(P<0.05),而同时过表达miR-876-5p和ciRS-7后MAGE-A mRNA的表达水平明显恢复(P<0.05)。8.Western blot结果显示,过表达miR-876-5p后TE1和KYSE30细胞中MAGE-A蛋白的表达水平明显降低(P<0.05),而同时过表达miR-876-5p和ciRS-7后MAGE-A蛋白的表达水平明显恢复(P<0.05)。9.CCK-8实验和平板克隆形成实验结果显示,敲低MAGE-A基因可抑制TE1细胞的增殖能力(P<0.05)。划痕愈合实验和Transwell实验结果显示,敲低MAGE-A基因可抑制TE1细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。10.免疫组织化学染色结果显示,MAGE-A蛋白在原发性ESCC组织,转移淋巴结组织以及远处转移组织中呈现高表达,并且其表达水平与ESCC患者的高病理分级,淋巴结转移,远处转移或复发,以及不良预后显著相关(P<0.05)。小结:1.在TE1细胞中ciRS-7可与miR-876-5p海绵状结合,miR-876-5p能抑制ciRS-7的荧光素酶活性。2.过表达miR-876-5p能抑制ESCC细胞的增殖,迁移和侵袭能力;敲低miR-876-5p能增强ESCC细胞的增殖,迁移和侵袭能力。而且ciRS-7的过表达拮抗了miR-876-5p对ESCC细胞增殖,迁移和侵袭的抑制作用。3.肿瘤抗原MAGE-A家族在ESCC组织,转移性淋巴结组织和远处转移组织中高度表达,而且其表达水平与ESCC患者的高病理分级,淋巴结转移,远处转移或复发,以及不良预后有关。在TE1细胞中敲低MAGE-A基因后抑制了细胞的增殖,迁移和侵袭能力。4.miR-876-5p可直接靶向MAGE-A家族,并至少部分通过抑制MAGE-A家族的表达来控制ESCC细胞的增殖,迁移和侵袭。5.ciRS-7可在mRNA和蛋白水平上有效逆转miR-876-5p介导的肿瘤抗原MAGE-A家族的表达下调。而且ciRS-7在ESCC细胞中能以miR-876-5p剂量依赖性的方式逆转miR-876-5p对MAGE-A基因的抑制作用。第三部分体内验证ciRS-7对食管鳞状细胞癌作用机制的研究目的:体内验证ciRS-7对食管鳞状细胞癌的作用机制。方法:1.通过qRT-PCR分析86例ESCC组织标本中ciRS-7,miR-876-5p和MAGE-A基因的表达相关性。2.构建稳定过表达ciRS-7的TE1细胞株,同时转染miR-876-5p agomir后皮下接种,建立裸鼠异种移植瘤模型,待瘤子长出后瘤内注射miR-876-5p agomir,观察各组移植瘤的生长情况。3.采用免疫组织化学染色法检测各组裸鼠移植瘤组织中MAGE-A、Ki67、PCNA、MMP2和MMP9蛋白的表达情况。结果:1.qRT-PCR结果显示,ESCC组织中ciRS-7的表达水平与miR-876-5p的表达水平呈显著负相关(P<0.05);miR-876-5p的表达水平与MAGE-A基因的表达水平呈显著负相关(P<0.05);而ciRS-7的表达水平与MAGE-A基因的表达水平呈显著正相关(P<0.05)。2.与对照组相比,ciRS-7过表达组裸鼠皮下移植瘤的体积和重量均明显升高(P<0.05),miR-876-5p过表达组裸鼠皮下移植瘤的体积和重量均明显下降(P<0.05),而同时过表达ciRS-7和miR-876-5p的挽救实验组裸鼠皮下移植瘤的体积和重量均明显恢复。3.免疫组织化学染色结果显示,ciRS-7过表达组裸鼠皮下移植瘤组织中MAGE-A、Ki67、PCNA、MMP2和MMP9的表达水平均明显高于对照组(P<0.05),miR-876-5p过表达组裸鼠皮下移植瘤组织中MAGE-A、Ki67、PCNA、MMP2和MMP9的表达水平均明显低于对照组(P<0.05),而同时过表达ciRS-7和miR-876-5p的挽救实验组裸鼠皮下移植瘤组织中MAGE-A、Ki67、PCNA、MMP2和MMP9的表达水平均明显恢复。小结:1.ESCC组织中ciRS-7的表达水平与miR-876-5p的表达水平呈显著负相关,miR-876-5p的表达水平与MAGE-A基因的表达水平呈显著负相关,ciRS-7的表达水平与MAGE-A基因的表达水平呈显著正相关。2.ciRS-7可促进裸鼠异种移植瘤的生长和转移以及肿瘤抗原MAGEA家族的表达,miR-876-5p可抑制裸鼠异种移植瘤的生长和转移以及肿瘤抗原MAGE-A家族的表达,而且ciRS-7的过表达可部分逆转miR-876-5p对裸鼠异种移植瘤生长和转移以及肿瘤抗原MAGE-A家族表达的抑制作用。结论:环状RNA ciRS-7在ESCC组织中表达上调,且能促进ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并可通过作为miR-876-5p的分子海绵,抑制miR-876-5p对肿瘤抗原MAGE-A家族的靶向调控,从而发挥其在ESCC中的促癌作用。我们的研究提供了ciRS-7作为“miRNA海绵”的新证据,也为ESCC提供了新的潜在治疗靶点。