基于核酸的生物传感器的研究与应用

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核酸的结构多样性决定了其在生命过程中发挥重要作用且它具有高稳定性、易于合成和修饰等优点。本论文以核酸的多样结构为基础,结合一些高灵敏的信号放大技术以及具有独特性质的纳米材料和更可靠的电极修饰方式,构建几种新型的核酸生物传感器,期望能为今后传感器的发展提供新思路。本论文主要构建了基于核酸的几种新型生物传感器,并对其可行性及应用进行了探讨。本论文共分为六章,主要内容如下:第一章,详细介绍核酸及功能型核酸中适配体的概念和特点,并对其在传感器中的应用进行了概述。同时,对几种生物传感器的类型及应用进行了简要描述,并对本论文的研究目的和主要内容进行简单介绍。第二章,基于富含C碱基的DNA序列在弱酸性环境下可以形成的一种C-四链体结构(i-motif)的特性,成功构建了一种pH诱导型分子间Ⅰ-型开关。实验中,选用两条富C的DNA链用于开关的构建,首先,将一条5’末端修饰有巯基DNA链,通过Au-S的作用固定在金电极表面。同时将标记二茂铁(Fc)的互补链与其杂交进而形成Ⅰ-型开关纳米结构。开关在碱性或中性溶液中成伸展的双链构型,使得Fc远离电极表面,从而获得较弱的电流信号,此时开关为关闭(OFF)状态。而在弱酸性条件下,i-motif结构的形成使得Fc靠近电极表面,从而获得较强的电信号,此为打开(ON)状态。研究结果表明,电流信号的强弱与pH值在5.8~8.0的范围内呈良好的线性关系。该开关具有较低背景信号,且有望在此基础上建立了一种用于pH测量的可能平台。第三章,基于金属有机骨架(MOF,H2dtoaCu)构建了一种检测特定序列的双链DNA (dsDNA)的荧光传感器。该MOF材料对于染料标记的可形成三链结构的寡核苷酸(TFO)探针有很强的吸附作用,同时淬灭来自于染料的荧光。当目标dsDNA出现时,TFO能够与dsDNA的大沟槽通过Hoogsteen氢键作用形成三链结构,TFO脱离MOF表面,使得体系的荧光得到恢复。实验结果表明,荧光信号增强的程度与dsDNA浓度呈良好的线性关系,该传感器的检测限与石墨烯传感平台及DNA电化学传感器相比较,具有更低的检测限,其检测限低至1.3nmol/L(S/N=3),具有良好的选择性。第四章,基于TFO与dsDNA的相互作用构建了一种的阻抗型电化学生物传感器。TFO探针通过Au-S键固定于金电极表面,当目标dsDNA存在时,探针TFO通过Hoogsteen氢键和dsDNA的大沟槽反应形成精密的三螺旋结构,由于dsDNA带有负电荷,阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-扩散到电极表面,从而导致测得的阻抗增加,利用此原理来定量检测dsDNA含量。实验结果表明,其阻抗值的大小与目标物浓度在0.1-40 nmol/L范围内呈良好的线性关系,且该方法的检测限可达0.04 nmol/L (S/N=3)。第五章,基于超分支滚环扩增技术(HRCA)成功构建了一种用于汞离子检测的高灵敏度高选择性的荧光传感器。当有汞离子存在时,锁式探针的末端会与互补的引发探针通过T-Hg2+-T的仿生结构进行杂交,使得锁式探针的5’和3’端相互靠近,并在E.coli. DNA连接酶的作用下形成环状锁式探针。随后,环化锁式探针便作为模板引发HRCA反应。HRCA产物包含大量的不同长度的双链DNA (dsDNA),由于荧光染料SYBR Green Ⅰ可以嵌入dsDNA产生很强的荧光信号,从而达到对汞离子检测的目的。实验发现,荧光强度与目标物浓度在4.25×10-13~4.25×10-8mol/L内呈线性关系,且检测限低至1.4×10-13mol/L(S/N=3)。第六章,基于GCE-APTES-rGO电极成功构建了一种用于凝血酶检测的电化学传感器。首先,将凝血酶适配体互补链通过共价键合作用固定于GCE-APTES-rGO上,再经由双链的杂交作用将二茂铁(Fc)标记的凝血酶适配体链也固定于电极表面从而构成了用于检测凝血酶的电化学传感器。当体系中不存在目标蛋白时,Fc由于靠近电极表面而产生一个很强的电流信号,而当目标物存在时Fc标记适配体则会与其结合而远离电极表面,使得法拉第电信号减弱。电信号强度随着目标物浓度增大而逐渐降低,通过这种方式来实现对目标蛋白的检测,检测限达到0.03 nmol/L。该传感器的修饰电极表面表现出良好的稳定性。
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