论文部分内容阅读
骨肉瘤是青少年常见、90%左右转移灶发生于肺部的原发高度恶性骨肿瘤，尽管目前新辅助化疗联合保肢手术的标准治疗使得骨肉瘤患者的生存期较前有所延长，但伴有肺转移患者的治疗效果及预后仍旧极差，阐明骨肉瘤生物学行为及转移相关分子机制成为突破骨肉瘤生存率及治疗停滞期瓶颈的关键。LncRNA是一类长度超过200nt且缺乏开放阅读框的RNA分子，参与人类众多疾病的发生发展，FOXD2-AS1是一种新的致癌LncRNA分子，其在肝癌、膀胱癌和非小细胞肺癌等多种肿瘤中发挥重要的生物学作用，但FOXD2-AS1对骨肉瘤生物学行为的影响及作用机制尚不清楚。
本研究前期通过高通量测序技术对5对骨肉瘤组织及瘤旁组织测序并筛选出具有研究价值的LncRNAs，通过文献检索、深入研究需要，并结合差异倍数筛选出FOXD2-AS1作为研究对象。检测骨肉瘤组织、正常组织和骨肉瘤细胞系及正常成骨细胞系中FOXD2-AS1表达差异性、分析Kaplan-Meier生存曲线发现，FOXD2-AS1表达高低与骨肉瘤患者的生存期密切相关，提示FOXD2-AS1可能是影响骨肉瘤细胞生物学行为的一种新的分子标志物。如能进一步阐述其相关作用机制，将可能为骨肉瘤提供一种新的潜在治疗靶点及有效途径。
目的
1.通过实时定量聚合酶链式反应检测FOXD2-AS1在骨肉瘤组织、正常组织和骨肉瘤细胞及人SV40转染成骨细胞中表达水平的差异性，并通过Kaplan-Meier生存曲线分析FOXD2-AS1表达水平与患者生存期的相互关系。
2.利用慢病毒干扰技术，通过体内体外实验研究FOXD2-AS1表达水平对骨肉瘤细胞增殖、克隆、迁移、侵袭及周期的作用。
3.通过荧光原位杂交技术明确FOXD2-AS1在骨肉瘤细胞内表达位置，并通过实时定量聚合酶链式反应和免疫印迹的方法检测可能影响的下游蛋白表达情况。
方法
1.选取自2012年7月-2014年8月本科室手术切除的骨肉瘤组织及瘤旁组织共40对，RT-PCR检测FOXD2-AS1在骨肉瘤组织、瘤旁组织及骨肉瘤细胞、人SV40转染成骨细胞内的表达情况，并通过Kaplan-Meier生存曲线分析FOXD2-AS1与骨肉瘤患者生存期的相互关系。
2.利用慢病毒稳转方法稳定干扰骨肉瘤细胞SOSP-9607和U20S内FOXD2-AS1(shRNA FOXD2-AS1)的表达，通过RT-PCR检测其沉默FOXD2-AS1的表达效果。
3.通过CCK8、细胞周期、平板克隆、细胞迁移、侵袭实验及裸鼠成瘤实验验证shRNAFOXD2-AS1沉默FOXD2-AS1基因表达后对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭及克隆等能力的影响。
4.利用荧光原位杂交技术验证FOXD2-AS1在骨肉瘤细胞内的亚定位，并通过RNA核质分离技术检测FOXD2-AS1在细胞内分布与表达情况。
5.沉默FOXD2-AS1表达后，通过RT-PCR和Westernblot检测下游蛋白的表达情况。
结果
1.RT-PCR结果显示：40对骨肉瘤标本中，有32对中骨肉瘤组织内FOXD2-AS1表达高于瘤旁组织(32/40)，阳性表达率为80%，显著高于瘤旁组织；骨肉瘤细胞内FOXD2-AS1表达高于人SV40转染成骨细胞。Kaplan-Meier生存曲线分析结果表明高表达FOXD2-AS1组患者生存期明显低于低表达FOXD2-AS1组患者。
2.成功构建稳定干扰FOXD2-AS1(shRNA)慢病毒，并稳转骨肉瘤细胞SOSP-9607和U20S，通过RT-PCR检测稳转后SOSP-9607和U20S内FOXD2-AS1表达较对照组细胞显著下调。
3.CCK8、细胞周期、平板克隆、细胞迁移、侵袭实验及裸鼠成瘤实验发现下调FOXD2-AS1基因表达后，骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭及克隆能力相比于对照组明显受到抑制。裸鼠成瘤实验发现下调FOXD2-AS1基因表达后，原位肿瘤相比于对照组肿瘤体积明显减小，其肺转移结节也明显减少。
4.荧光原位杂交实验和RNA核质分离实验发现：FOXD2-AS1在细胞内的表达相比于细胞核，其主要存在细胞质中。RT-PCR和Westernblot实验发现，下调细胞内FOXD2-AS1表达后，下游蛋白RRM2和PHGDH表达量明显下降。
结论
1.相比于瘤旁组织，FOXD2-AS1在骨肉瘤组织内为高表达，且FOXD2-AS1表达水平和骨肉瘤患者的生存期明显相关。FOXD2-AS1在骨肉瘤细胞内的表达也明显高于人SV40转染成骨细胞(hFOB1.19)。
2.稳定干扰FOXD2-AS1表达后，骨肉瘤细胞的增殖、克隆、迁移及侵袭能力明显减弱，裸鼠体内成瘤实验发现，原位肿瘤生长减慢，其肺转移结节也明显减少。
3.FOXD2-AS1的表达主要位于细胞质中，且下调FOXD2-AS1表达后，其下游蛋白RRM2和PHGDH表达也明显减少。
4.FOXD2-AS1有可能成为骨肉瘤患者诊疗的潜在靶点，并为进一步探究FOXD2-AS参与骨肉瘤肺转移等相关分子机制提供了研究基础。
本研究前期通过高通量测序技术对5对骨肉瘤组织及瘤旁组织测序并筛选出具有研究价值的LncRNAs，通过文献检索、深入研究需要，并结合差异倍数筛选出FOXD2-AS1作为研究对象。检测骨肉瘤组织、正常组织和骨肉瘤细胞系及正常成骨细胞系中FOXD2-AS1表达差异性、分析Kaplan-Meier生存曲线发现，FOXD2-AS1表达高低与骨肉瘤患者的生存期密切相关，提示FOXD2-AS1可能是影响骨肉瘤细胞生物学行为的一种新的分子标志物。如能进一步阐述其相关作用机制，将可能为骨肉瘤提供一种新的潜在治疗靶点及有效途径。
目的
1.通过实时定量聚合酶链式反应检测FOXD2-AS1在骨肉瘤组织、正常组织和骨肉瘤细胞及人SV40转染成骨细胞中表达水平的差异性，并通过Kaplan-Meier生存曲线分析FOXD2-AS1表达水平与患者生存期的相互关系。
2.利用慢病毒干扰技术，通过体内体外实验研究FOXD2-AS1表达水平对骨肉瘤细胞增殖、克隆、迁移、侵袭及周期的作用。
3.通过荧光原位杂交技术明确FOXD2-AS1在骨肉瘤细胞内表达位置，并通过实时定量聚合酶链式反应和免疫印迹的方法检测可能影响的下游蛋白表达情况。
方法
1.选取自2012年7月-2014年8月本科室手术切除的骨肉瘤组织及瘤旁组织共40对，RT-PCR检测FOXD2-AS1在骨肉瘤组织、瘤旁组织及骨肉瘤细胞、人SV40转染成骨细胞内的表达情况，并通过Kaplan-Meier生存曲线分析FOXD2-AS1与骨肉瘤患者生存期的相互关系。
2.利用慢病毒稳转方法稳定干扰骨肉瘤细胞SOSP-9607和U20S内FOXD2-AS1(shRNA FOXD2-AS1)的表达，通过RT-PCR检测其沉默FOXD2-AS1的表达效果。
3.通过CCK8、细胞周期、平板克隆、细胞迁移、侵袭实验及裸鼠成瘤实验验证shRNAFOXD2-AS1沉默FOXD2-AS1基因表达后对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭及克隆等能力的影响。
4.利用荧光原位杂交技术验证FOXD2-AS1在骨肉瘤细胞内的亚定位，并通过RNA核质分离技术检测FOXD2-AS1在细胞内分布与表达情况。
5.沉默FOXD2-AS1表达后，通过RT-PCR和Westernblot检测下游蛋白的表达情况。
结果
1.RT-PCR结果显示：40对骨肉瘤标本中，有32对中骨肉瘤组织内FOXD2-AS1表达高于瘤旁组织(32/40)，阳性表达率为80%，显著高于瘤旁组织；骨肉瘤细胞内FOXD2-AS1表达高于人SV40转染成骨细胞。Kaplan-Meier生存曲线分析结果表明高表达FOXD2-AS1组患者生存期明显低于低表达FOXD2-AS1组患者。
2.成功构建稳定干扰FOXD2-AS1(shRNA)慢病毒，并稳转骨肉瘤细胞SOSP-9607和U20S，通过RT-PCR检测稳转后SOSP-9607和U20S内FOXD2-AS1表达较对照组细胞显著下调。
3.CCK8、细胞周期、平板克隆、细胞迁移、侵袭实验及裸鼠成瘤实验发现下调FOXD2-AS1基因表达后，骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭及克隆能力相比于对照组明显受到抑制。裸鼠成瘤实验发现下调FOXD2-AS1基因表达后，原位肿瘤相比于对照组肿瘤体积明显减小，其肺转移结节也明显减少。
4.荧光原位杂交实验和RNA核质分离实验发现：FOXD2-AS1在细胞内的表达相比于细胞核，其主要存在细胞质中。RT-PCR和Westernblot实验发现，下调细胞内FOXD2-AS1表达后，下游蛋白RRM2和PHGDH表达量明显下降。
结论
1.相比于瘤旁组织，FOXD2-AS1在骨肉瘤组织内为高表达，且FOXD2-AS1表达水平和骨肉瘤患者的生存期明显相关。FOXD2-AS1在骨肉瘤细胞内的表达也明显高于人SV40转染成骨细胞(hFOB1.19)。
2.稳定干扰FOXD2-AS1表达后，骨肉瘤细胞的增殖、克隆、迁移及侵袭能力明显减弱，裸鼠体内成瘤实验发现，原位肿瘤生长减慢，其肺转移结节也明显减少。
3.FOXD2-AS1的表达主要位于细胞质中，且下调FOXD2-AS1表达后，其下游蛋白RRM2和PHGDH表达也明显减少。
4.FOXD2-AS1有可能成为骨肉瘤患者诊疗的潜在靶点，并为进一步探究FOXD2-AS参与骨肉瘤肺转移等相关分子机制提供了研究基础。