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益生菌制剂以其无毒、无耐药性、无残留以及效果显著、成本低、能有效补充消化道内的有益微生物等诸多优点,已成为了理想的抗生素替代品而被广泛应用。本课题从安徽地方猪肠道中筛选两株益生菌,利用体外法分析和肠道上皮模型研究其益生菌特性和机理。通过益生菌对断奶仔猪的饲喂试验,研究益生菌在胃肠道中的作用机制,分析益生菌是在减缓仔猪断奶应激方面的作用。各试验的研究内容如下:一、猪源益生芽孢杆菌、乳酸菌的筛选及鉴定本研究采用稀释涂平板法以抑制病原菌的生长和耐受消化道环境为筛选指标从安徽地方品种健康仔猪肠道内容物中分离到能够抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌且能够耐受消化不良环境的乳酸菌和芽孢杆菌菌各一株,通过形态学、生理生化、16Sr DNA分子特性等多相生物学鉴定其为罗伊氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌,故分别命名为罗伊氏乳杆菌R-1和枯草芽孢杆菌D-2,送中国典型微生物保藏中心做专利保藏,保藏号分别为CCTCC M2015660和CCTCC M2015457。二、益生菌体外益生特性研究为研究D-2和R-1的产酶特性,采用橄榄油浮化法测度脂肪酶,福林酚法测定蛋白酶,Yoo改良法测定淀粉酶,及DNS法测定纤维素酶,通过检测D-2和R-1培育上清液及无细胞提取液的DPPH自由基、羟自由基(·OH)和超氧阴离子(O2-)清除率、还原力以及抗氧化酶含量研究两株菌的体外抗氧化特性,结果两株菌均有一定的抗氧化能力;采用牛津杯法检测测菌株D-2和R-1体外抑菌特性。结果表明枯草芽孢杆菌D-2可产蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶,其中蛋白酶和淀粉酶的活性,分别达70.17U/ml和31.10U/ml,而罗伊氏乳杆菌R-1只检测到蛋白酶和纤维素酶酶活性、分别为21.17 U/ml和4.35U/ml。R-1抑菌能力在乳酸脱氢酶或碱处理后明显下降,而D-2的抑菌能力在各种处理下保持稳定;抗生素药敏纸片法研究D-2和R-1抗生素敏感性,显示两株益生菌均对常用的多种抗生素要具有很高的敏感性,表明菌株不含有耐药性质粒。三、益生菌对仔猪肠道上皮细胞益生作用及机理研究为了研究益生菌对仔猪肠道上皮细胞益生作用及机理,利用荧光标记法研究R-1和D-2对IPEC-J2细胞粘附,通过台盼蓝染色及乳酸脱氢酶活性检测分析R-1、D-2及大肠杆菌K88对IPEC-J2细胞活性的影响。结果表明罗伊氏乳杆菌R-1对1PEC-J2细胞的粘附率高于大肠杆菌K88,且对大肠杆菌K88黏附IPEC-J2细胞具有竞争阻断作用;枯草芽孢杆菌D-2对IPEC-J2细胞的黏附率低于大肠杆菌K88,且对大肠杆菌K88黏附IPEC-J2细胞无阻断作用。菌株R-1和D-2均对IPEC-J2细胞无毒害作用,而大肠杆菌K88会对IPEC-J2活性造成严重损伤,说明表明本试验筛选的罗伊氏乳杆菌R-1和枯草芽孢杆菌D-2作为益生菌是安全的,酶联免疫法检测分析R-1、D-2及大肠杆菌K88对IPEC-J2细胞因子分泌情况,结果表明R-1及D-2可通过调节细胞因子的分泌影响IPEC-J2细胞免疫功能。四、益生菌对断奶仔猪腹泻指数、抗氧化及免疫指标的影响采用单因素完全随机试验设计,选用120头健康、平均体重为6.9-7.1kg的三元杂交(杜×长×大)28日龄断奶仔猪。根据体重相近,公、母比例一致的原则,随机分成4组,每组设3个重复,每个重复10头。试验分四种日粮,对照组饲喂基础日粮,试验Ⅰ组饲喂在基础饲粮中添加枯草芽孢杆菌D-2(使日粮活菌数达107CFU/g)的试验饲粮,试验Ⅱ组饲喂在基础饲粮中添加罗伊氏乳杆菌R-1(使日粮活菌数达107CFU/g)的试验饲粮,试验Ⅲ组基础日粮中的试验饲粮中添加1:1混合的枯草芽孢杆菌D-2和罗伊氏乳杆菌R-1(使日粮两者活菌数均分别达5×106CFU/g)),试验期维持28d。通过腹泻率的计算,肠道HE染色切片及抗氧化免疫指标的测定及研究,结果表明,日粮中添加益生菌能够显著降低断奶仔猪的腹泻率,益生菌制剂可以改善早期断奶仔猪机体的肠道健康,缓解早期断奶引起的仔猪氧化应激及免疫功能下降。五、益生菌肠道定植及对断奶仔猪肠道微生物多样性的影响采用单因素完全随机试验设计,试验设计同试验四,应用Real-time PCR方法准确地对停喂当天(28天)和停喂14天断奶仔猪粪便样本中的2株特定益生菌进行定量。结果表明2株益生菌均可以定植在仔猪胃肠道内。利用传统微生物培养和高通量测序技术对断奶仔肠道微生物菌群进行分析研究。结果显示,饲喂微生物制剂可以通过在仔猪消化道内定植来促进肠道益生菌的生长繁殖,抑制有害菌的生长,从而达到调节肠道菌群的效果。然而高通量测序分析结果表明添加益生菌不会改变断奶仔猪核心优势菌群,对整个菌群结构没有大的影响,但可以提高肠道微生物多样性。