目的及意义鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国南方及东南亚地区常见的一类恶性肿瘤,具有显著的区域分布特征、种族聚集性及早期转移倾向而有别于其他头颈部恶性肿瘤,目前认为其发病与EB病毒(EpsteinBarr virus, EBV)感染、化学致癌物以及遗传等因素相关,是一个多阶段、多途径、多机制参与的复杂过程,然而迄今为止,鼻咽癌发病的分子机制仍不完全清楚。MicroRNA (miRNA)作为一类新型基因调控物质,在肿瘤的发生发展中发挥了举足轻重的作用。MicroRNA是一类长度约19～25个核苷酸(nucleotide, nt)的非编码单链小分子RNA,在细胞内由大小约70～100 nt的RNA前体(pre-miRNA)经Dicer酶剪切加工而来,并通过与靶基因mRNA的3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)互补匹配而致该mRNA降解。MicroRN A广泛存在于动、植物及病毒中,并在体内发挥多种调控作用,研究证实其参与了包括动、植物组织器官的发育、细胞分裂、增殖、凋亡、分化、发育及体内代谢等多种生物学过程,其表达失调将导致疾病产生,例如肿瘤类疾病。目前为止与鼻咽癌有关的miRNA的研究主要集中于EB病毒编码的miRNA和机体产生的可直接参与鼻咽癌的miRNA这两类。现阶段的研究显示EB病毒与鼻咽癌的发生密切相关,然而并不是所有的鼻咽癌中都能检测出EB病毒的感染,且在部分患者体内尚可检测到人乳头状瘤病毒-16、人巨细胞病毒等病毒感染的迹象。那么,这些非EB病毒的感染是否也能对鼻咽癌的发生发展产生影响呢?早前已有研究者发现人巨细胞病毒与炎症反应性疾病及肿瘤的关系非常密切。人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV)属人类疱疹病毒β亚科,70-100%的人群普遍感染该病毒,由于长期与人类免疫系统共进化,该病毒形成了多种分子机制来逃避机体免疫系统的监视,产生免疫逃逸,从而达到在体内长期潜伏的目的,机体免疫功能缺陷或受到抑制的人群感染该病毒,可致相应临床症状甚至引发死亡。多项研究表明,HCMV可刺激细胞周期的进程、诱发突变形成、诱导血管再生、促进细胞侵袭性并能有效地影响病毒复制、基因表达和蛋白的转运,从而导致疾病的产生。最新的研究显示,HCMV参与炎症反应,与动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、肿瘤(如人类恶性胶质细胞瘤、Kaposi肉瘤、EBV阳性的Hodgkin淋巴瘤、宫颈癌、前列腺癌等)等疾病相关,并探索性发现其在调节肿瘤微小环境以及在肿瘤细胞自身发展的初期和进展期扮演了重要的角色。那么,HCMV与鼻咽癌有无关系?本课题组前期miRNA芯片杂交技术及TargetScan在线预测,意外的发现HCMV-miR-UL148D与某些与鼻咽癌关系密切同时又与TGF-βR2 (transforming gorwth factor β Receptor 2)密切相关的候选miRNAs (如:mir-20a20、mir-93、mir-17-5p等)聚类在一起,提示该niRNA可能与这些候选miRNAs有类似的功能,可通过调控TGF-βR2表达参与鼻咽癌的发病过程。转化生长因子β (Transforming growth factor β, TGF-β)是一类多功能生长因子,广泛参与体内各种病理生理活动,可影响细胞的增殖分化,并在胚胎及神经系统的发育、骨的改建、细胞外基质的形成、免疫调节、创伤愈合及肿瘤的发生、发展等过程中发挥作用。大量研究证实,TGF-β信号通路在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用,且TGF-βR1和TGF-β2在该通路中发挥着核心作用,这些受体表达缺失是导致肿瘤发生的一个重要原因。目前已经证实TGF-β与肺癌、子宫平滑肌瘤、前列腺癌、多发性骨髓瘤等多种肿瘤的发展和转移有关,并已有研究数据显示鼻咽癌组织中TGF-PR2的表达下调,这就为我们后续的研究提供了更有力的证据。鉴于相关文献依据及本课题组前期工作基础,拟通过荧光定量PCR及原位杂交技术检测HCMV-miR-UL148D在鼻咽癌组织和鼻咽部慢性炎症组织中的表达情况；建立过表达HCMV-miR-UL148D的鼻咽癌细胞株,通过体外功能实验,观察分析HCMV-miR-UL148D对鼻咽癌细胞增殖、侵袭转移能力的影响；通过生物信息学预测HCMV-miR-UL148D的靶基因,观测在改变HCMV-miR-UL148D的表达后该microRNA靶基因的变化,并探索其可能的调控途径;观察HCMV-miR-UL148D表达失调后,鼻咽癌细胞EMT相关指标的变化。材料和方法1.细胞培养永生化鼻咽上皮细胞NP69采用KMSF培养基,人鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、 CNE1、CNE2采取含10%胎牛血清+RPMI 1640培养基,293T细胞采用DMEM培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下进行传代培养。2.临床标本收集60例鼻咽癌组织和21例鼻咽部慢性炎症组织均来源于广东省中山市人民医院标本库,所有标本均为鼻咽部活检组织,均尚未接受放化疗治疗,行荧光定量PCR及原位杂交检测,分析HCMV-miR-UL148D的表达情况。3. Poly (A)法荧光定量PCR抽提细胞及组织的总RNA,按Poly(A)法逆转录成cDNA后,采用SYBR Green法进行PCR扩增,通过相对定量以2-A△Ct值代表基因相对表达强度。4.原位杂交技术将新鲜标本组织制成的切片,经阻断过氧化物酶、暴露mRNA核酸片段、预杂交、杂交、洗涤、封闭、滴加生物素化鼠抗地高辛、滴加SABC、滴加生物素化过氧化物酶、DAB显色、酒精脱水、透明、封片等步骤后,在光镜下观察原位杂交染色情况,阳性信号呈棕黄色,根据c-erbB-2免疫组化新的判定标准将染色结果分为：阴性：“0”或“+”；可疑：“++”；阳性：即超过30%的肿瘤细胞呈现完整的细胞膜染色,判定为“+++”。5.细胞瞬时转染瞬时转染采用阳离子脂质体法,将HCMV-miR-UL148D及N C的mimics转入鼻咽癌细胞株CNE1 及 6-10B中。转染24h后,抽提细胞总RNA,逆转录后荧光定量PCR检测HCMV-miR-UL148D表达变化情况,细胞转染成功后,可进行后续实验。6.细胞生物学实验(1)MTT实验：接种2×103个细胞于96孔板中,将细胞分别培养24、48和72h,每孔加入5mg/ml MTT 20μl,37℃继续培养4h后,吸弃96孔板内培养基,加入DMSO 200μl,使结晶物充分溶解后,利用酶标仪测定490nm处的OD值,取各组平均值,绘制增殖曲线。(2)平板克隆形成实验：取生长状态良好的CNE1和6-10B细胞,胰酶消化后制成细胞悬液,按200个细胞每孔,接种到6孔板中,37℃、5%CO2孵箱中培养14天,出现肉眼可见的细胞克隆后终止培养,经甲醇固定、结晶紫染色,干燥后显微镜下计数。(3)Boyden小室体外侵袭实验：于小室滤膜上均匀涂布一层无血清RPMI-1640培养基稀释的Matrigel胶45μl,常规37℃孵育2h进行水化,将细胞经胰酶消化后以无血清培养基洗涤细胞制作细胞悬液,均匀接种密度为2.5×105个细胞/ml至上室,加入500μl完全培基至下室,37℃、5%CO2孵箱中培养36h后,经甲醛固定、结晶紫染色,显微镜下计数穿膜细胞数。(4) Transwell小室体外迁移实验：于小室内加入无血清的RPMI-1640培养基50μl,常规37℃孵育2h进行水化,余步骤与Boyden小室体外侵袭实验相同。7.生物信息学预测以HCMV-miR-UL148D为检索词,利用miRBase (http://www.mirbase.org/)、 TargetScan (http://www.targetscan.org/)和RNAhybrid(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)三个在线数据库进行靶基因的预测。8.萤火虫荧光素酶活性检测将293T细胞按2.5×105接种于24孔板中,待载体瞬时转染24h后,裂解细胞,利用化学发光检测仪测定Renilla luciferase以及Firefly luciferase的活性。同时,为校正转染效率共转入pRL-SV40质粒作为内对照,荧光素酶的相对活性为Firefly luciferase与Renilla luciferase的活性比值,然后再进行不同样本间的比较。9. Western Blotting裂解液充分裂解细胞后,抽提总蛋白,利用BCA法测定总蛋白的浓度,遂10%SDS-PAGE行电泳、转膜、杂交, Bio-Rad化学发光成像系统(Molecμlar Imager (?) ChemiDocTM XRS+ Imaging System)成像,蛋白的相对表达强度使用Image Lab软件进行测定。结果1.鼻咽癌组织中HCMV-miR-UL148D的表达(1)Poly (A)法荧光定量PCR显示：HCMV-miR-UL148D在60例鼻咽癌组织中的表达高于21例鼻咽慢性炎症组织,两者表达具有显著差异(P=0.0001)。(2)原位杂交技术：直观的显示出HCMV-miR-UL148D在鼻咽癌组织中的分布情况,HCMV-miR-UL148D信号高表达于鼻咽癌细胞膜,而在阴性对照组中表达较弱。2.过表达HCMV-miR-UL148D对鼻咽癌细胞增殖及侵袭转移能力的影响(1)过表达HCMV-miR-UL148D鼻咽癌细胞株的构建采用瞬时转染法按LipofectamineTM2000试剂说明书进行操作,建立过表达H CMV-miR-UL148D的鼻咽癌细胞株CNE1和6-10B。(2)过表达HCMV-miR-UL148D促进鼻咽癌细胞增殖及侵袭转移能力①MTT比色试验提示：过表达HCMV-miR-UL148D后,鼻咽癌细胞CNE1及6-10B的生长速度分别增长了1.312倍及1.61倍,具有统计学差异(P<0.001)。②平板克隆形成实验：过表达HCMV-miR-UL148D后,鼻咽癌细胞CNE1及6-10B增殖能力分别增加了68.3%及66.5%,具有显著统计学差异(P<0.001)。③Boyden体外侵袭实验：过表达HCMV-miR-UL148D后,鼻咽癌细胞CNE1及6-10B体外侵袭能力分别增加了72.4%及63.2%,具有显著差异(P<0.001,P=0.0011)。④Transwell体外迁移实验：过表达HCMV-miR-UL148D后,鼻咽癌细胞CNE1及6-10B体外迁移能力分别增加了65.9%及54.8%,具有显著差异(P<0.001)。3. HCMV-miR-UL148D促进鼻咽癌的分子机理(1)生物信息学检测利用niRBase、TargetScan和RNAhybrid三个在线数据库对HCMV-miR-UL148D靶基因进行预测,结果发现HCMV-miR-UL148D与TGF-βR2的3’UTR较好的互补结合,且得分较高,结果可靠,提示TGF-βR2可能为HCMV-miR-UL148D的靶基因。(2)萤火虫荧光素酶活性检测将HCMV-miR-UL148D mimics、miR control共转染目293T细胞株后检测荧光素酶活性,并分析结果,提示共转HCMV-miR-UL148D后荧光素酶活性较对照组明显下降,且差异具有统计学意义(P<0.03),提示TGF-βR2为HCMV-miR-UL148D的靶基因。(3)鼻咽癌细胞中TGF-βR2的表达荧光定量PCR结果显示,在4种鼻咽癌细胞株,即CNE1、CNE2、5-8F、6-10B中TGF-βR2的表达均低于永生化鼻咽上皮细胞NP69(P=0.002)。其中低分化鼻咽癌上皮细胞CNE2中TGF-βR2的表达水平明显低于高分化鼻咽癌上皮细胞CNE1(P=0.024),具有转移能力的5-8F细胞中TGF-βR2的表达水平低于不转移的细胞6-10B(P=0.014)。过表达HCMV-miR-UL148D后,Western Blotting证实CNE1及6-10B细胞T GF-βR2蛋白表达下调。(4) HCMV-miR-UL148D过表达对CNEl细胞EMT相关指标的影响Western Blotting分析过表达HCMV-miR-UL148D后CNE1蛋白水平变化,结果显示过表达HCMV-miR-UL148D可使鼻咽癌细胞的上皮标志物(E-cadherin)表达下调,间质标志物(Vimentin)的表达明显上调。结论1.原位杂交技术显示HCMV-miR-UL148D不仅存在于鼻咽癌组织当中,且表达显著高于鼻咽部慢性炎症组织,Poly (A)法荧光定量PCR也进一步验证了鼻咽癌组织中HCMV-miR-UL148D的表达明显高于鼻咽部慢性炎症组织。2.采用瞬时转染使鼻咽癌细胞过表达HCMV-miR-UL148D后,可使该肿瘤细胞体外增殖及侵袭转移能力增强,表明HCMV-miR-UL148D可能为鼻咽癌的促癌基因。3.过表达HCMV-miR-UL148D后TGF-βR2在鼻咽癌细胞中的表达下调,并使EMT相关蛋白的表达发生变化,表明HCMV-miR-UL148D可通过诱导EMT的发生,促进鼻咽癌的转移,提示该miRNA可能通过调控TGF-p相关信号通路,参与鼻咽癌的发病。