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目的脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,由于其侵袭性生长方式,造成手术后易复发,放、化疗效果差,患者死亡率居高不下,迫切需要寻找新的治疗手段改善疗效。近年来,随着对胶质瘤发病机制的进一步认识,针对细胞受体、关键基因和调控分子的靶向性基因治疗方案日益引起研究者的关注,寻找靶向性基因治疗所需要的能定向迁移、直达肿瘤局部释放活性因子的运送载体无疑具有很高的研究价值。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种来源于中胚层,具有多向分化潜能和定向迁移能力的成体干细胞,其取材方法简单,易于体外扩增,外源基因表达稳定,并且还可以通过自体取材分离BMSCs避免免疫排斥反应以及异体干细胞移植可能出现的伦理问题。BMSCs可在多种细胞因子和趋化因子作用下发生定向迁移运动,具有向颅内缺血、炎症、肿瘤病灶趋化迁移的特性。干细胞因子(Stem cell factor,SCF)是由c-kit原癌基因编码合成酪氨酸激酶的配体,SCF不但是一种促使干细胞向受损脑组织迁移的重要因子,而且通过与其受体c-kit之间的相互作用在胶质瘤组织形成新生血管的过程中发挥重要作用。细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)是免疫球蛋白超家族的一员。作为一种重要的粘附分子,ICAM-1在BMSCs表面表达,而且是BMSCs鉴定时使用的表面标志之一,介导细胞与细胞之间相互接触和结合的反应过程。作为MAPK信号通路家族的一员,p38MAPK是一条重要的细胞内信号转导通路,广泛参与了包括细胞迁移在内的一系列生理和病理反应过程。深入研究信号转导通路p38MAPK与SCF诱导的BMSCs迁移和粘附因子ICAM-1表达之间的关系有助于明确BMSCs向胶质瘤趋化迁移的机制。本实验首先建立大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养体系,在此基础之上利用体外趋化迁移模型证实大鼠BMSCs具有向C6胶质瘤趋化迁移的能力,然后进一步利用大鼠颅内C6胶质瘤模型观察经颈内动脉移植后BMSCs是否能够通过血脑屏障向C6胶质瘤组织趋化迁移,分析SCF在BMSCs向C6胶质瘤定向迁移过程中的作用,探讨SCF对BMSCs表达ICAM-1的影响,研究p38MAPK信号通路与SCF诱导的BMSCs迁移和粘附因子ICAM-1表达之间的关系,初步阐明SCF在BMSCs向胶质瘤定向迁移过程中的作用。本研究所取得的结果将为以BMSCs作为运送载体的胶质瘤靶向性基因治疗方案提供实验和理论依据,并为进一步研究提高BMSCs向胶质瘤组织的迁移效率提供新思路。材料和方法一、大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及向C6胶质瘤的趋化迁移(一)实验材料1、动物:Wistar大鼠,4-6周龄,体重60-80g,BMSCs培养原代取材使用;Wistar大鼠,体重200-250g,建立大鼠颅内C6胶质瘤模型使用。2、主要试剂:Ficoll-paque离心液;兔抗大鼠CD34,CD44,CD54,CD105,GFAP,NSE多克隆抗体,小鼠抗大鼠CD45多克隆抗体;BrdU,小鼠抗BrdU单克隆抗体;SABC试剂盒,DAB酶底物显色试剂盒;β-巯基乙醇,碘化丙啶。3、主要仪器:超净工作台;二氧化碳培养箱;倒置显微镜;流式细胞仪;Transwell小室;微量注射泵;切片机。(二)实验方法1、密度梯度离心和贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs。2、免疫组织化学方法鉴定BMSCs表面标志。3、测定BMSCs生长曲线和细胞周期,评估BMSCs向神经元样细胞分化的能力。4、利用Transwell体外趋化迁移模型评估BMSCs向C6胶质瘤细胞趋化迁移的能力。5、立体定向技术建立大鼠颅内C6胶质瘤模型,在使用BrdU标记BMSCs后,经肿瘤同侧颈内动脉移植BMSCs,观察经颈内动脉移植后BMSCs向胶质瘤的趋化能力,评价BMSCs作为胶质瘤基因治疗运送载体的可行性。二、大鼠骨髓间充质干细胞向C6胶质瘤趋化迁移机制初探(一)实验材料1、动物:4-6周龄Wistar大鼠,体重60-80g。2、主要试剂:Ficoll-paque离心液;兔抗大鼠SCF、c-kit多克隆抗体;小鼠抗大鼠ICAM-1单克隆抗体;重组大鼠SCF,大鼠SCF中和型抗体;p38MAPK信号通路抑制剂SB203580,二甲基亚砜;Trizol;RNA PCR kit(AMV ver3.0)。3、主要仪器:超净工作台;二氧化碳培养箱;倒置显微镜;Transwell小室;紫外可见光分光光度计;PCR仪;电泳仪;凝胶成像系统;荧光显微镜。(二)实验方法1、RT-PCR和免疫组化方法检测C6胶质瘤细胞对SCF的表达以及BMSCs对SCF受体c-kit的表达。2、利用体外模型评价SCF对BMSCs向C6胶质瘤细胞趋化迁移和粘附能力的影响。3、RT-PCR和免疫荧光方法检测SCF对BMSCs表达ICAM-1的影响。4、RT-PCR和免疫荧光方法检测p38MAPK抑制剂SB203580对SCF诱导的BMSCs定向迁移和ICAM-1表达变化的影响。实验结果一、大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及向C6胶质瘤的趋化迁移1、利用密度梯度离心法和贴壁培养方法分离培养BMScs,并予以传代;表面标志鉴定结果显示BMSCs对CD44、CD54、CD105呈阳性表达,CD34、CD45呈阴性表达;经流式细胞仪检测大于70%以上的细胞处于G0/G1期,仅少数细胞处于S和G2/M期,符合干细胞的特点;经β-巯基乙醇诱导后实验中所获得的BMSCs能够分化成为神经元样细胞。2、Transwell体外趋化迁移模型证实C6细胞培养上清可以诱导BMSCs向其定向迁移。3、利用BrdU标记BMSCs后经颈内动脉灌注,BMSCs可以通过血脑屏障向C6胶质瘤组织趋化迁移;具备在荷瘤鼠脑内存活的能力。在C6肿瘤组织内以及肿瘤组织和正常脑组织交界区域都可见BMSCs分布,正常脑组织内未见BMSCs分布。二、大鼠骨髓间充质干细胞向C6胶质瘤趋化迁移机制初探1、RT-PCR和免疫组化方法检测结果证实C6胶质瘤细胞表达SCF,大鼠BMSCs表达SCF受体c-kit。2、体外趋化迁移实验结果显示SCF可诱导BMSCs定向迁移。在C6培养上清内加入SCF中和型抗体后,通过聚碳酸酯膜发生迁移的细胞数量减少,SCF是诱导BMSCs向C6细胞趋化迁移的细胞因子之一。3、SCF可以上调BMSCs对ICAM-1的表达,增强BMSCs的迁移和粘附能力。4、阻断p38MAPK后SCF诱导的BMSCs迁移以及对ICAM-1的上调表达受到抑制。结论1、C6细胞培养上清具有诱导BMSCs向其定向迁移的作用;经颈内动脉移植后BMSCs具有通过血脑屏障向C6胶质瘤趋化迁移的能力,可将BMSCs作为胶质瘤基因治疗的细胞载体,经颈内动脉灌注是BMSCs移植的有效途径。2、SCF是导致BMSCs向C6细胞趋化迁移的细胞因子之一,SCF可以上调BMSCs对ICAM-1的表达,并且能够增强BMSCs的粘附能力以及向C6细胞的迁移的能力;p38MAPK是此过程相关信号转导通路中重要的信号分子之一。