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研究背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是目前最常见的一类恶性肿瘤。研究表明,乙型和丙型肝炎病毒感染、黄曲霉素等是诱导肝癌的主要因素,中国每年约1 1万人死于肝癌,约占全世界肝癌死亡人数的45%。目前临床上主要采用手术、放化疗与中药联合疗法。然而,化疗药治疗具有副作用大、耐药性高、患者易复发等缺点,而放疗让患者治疗区汗腺丧失功能,严重影响患者正常生活。近年来,肿瘤免疫疗法在恶性肿瘤治疗中取得了良好的效果,但是也存在有效率过低、价格高昂等不足。因此,针对肝癌的治疗手段仍然处于不断的探索中。肿瘤糖酵解作为肿瘤细胞的主要供能方式。许多研究表明,靶向糖酵解能有效切断肿瘤能量来源,从而抑制肿瘤细胞的发生发展。肿瘤糖酵解作为当前的研究热点,是一个很有前景的肝癌治疗靶点。近年来,干预糖酵解也被作为针对肝癌的治疗手段,许多药物如2-DG等糖酵解抑制剂也处于临床研究阶段,通过单独或者联合治疗的方式来检测其对于肝癌的治疗效果。肿瘤抑制基因是一类存在与正常细胞中的、与原癌基因共同调控细胞生长和分化的基因,也称为抑癌基因。作为经典的肿瘤抑制基因,RB1（Retinoblastomal）参与调控多种肿瘤生物学行为,在多种肿瘤细胞中表达降低并且失活。RB1主要通过与下游的E2F转录因子结合后,抑制E2F转录因子家族对下游靶基因的调控,从而调控细胞的周期、凋亡等相关因子的表达。但是,RB1对HCC肿瘤生物学特征的影响及分子机制尚未详细阐述。基于此,我们通过分子生物学、细胞生物学及小鼠模型,研究RB1/E2F1轴对HCC细胞的肿瘤生物学行为影响及相关分子机制,观察其对HCC肿瘤免疫微环境的影响,为HCC的治疗提供潜在的治疗靶点。研究目的:1.分析RB1/E2F1轴对HCC肿瘤生物行为的影响;2.阐述RB1/E2F1轴调控肝癌细胞糖酵解的机制;3.探究RB1/E2F1轴对HCC肿瘤免疫微环境的影响;4.为HCC药物研发和治疗提供潜在的靶点。研究方法:1.通过TCGA数据库分析HCC患者中RB1表达相关数据,再通过qPCR、Western Blot等方法进一步验证;2.通过公司合成RB1基因扩增引物,经过连接、转化、鉴定及测序等方式构建过表达RB1载体,使用HEK-293T细胞及磷酸钙转染法进行慢病毒包装,得到过表达RB1慢病毒,使用病毒液感染Huh7和Hep3B两种HCC细胞,再通过qPCR和Western Blot验证RB1过表达效果;3.使用过表达RB1慢病毒感染Huh7/Hep3B细胞48h后,通过CCK8法检测RB1对HCC细胞增殖的影响,同时使用qPCR检测增殖相关基因Ki67的表达;4.将过表达RB1慢病毒感染Huh7/Hep3B细胞48h后,接种于24孔板,通过细胞划痕法检测过表达RB1对HCC细胞迁移能力的影响,同时通过qPCR、Western Blot检测迁移相关分子Vimentin、E-cadherin、N-cadherin等表达的变化;5.过表达RB1慢病毒感染Huh7/Hep3B细胞48h后,以5000个/孔的细胞接种于六孔板,使用克隆形成实验检测RB1对于HCC细胞干性的影响,并通过qPCR、Western Blot检测HCC干细胞标志分子的表达;6.利用流式细胞术,将过表达RB1的Huh7/Hep3B细胞通过Annexin V/7-AAD双染色法检测细胞凋亡/周期的变化,同时通过qPCR、Western Blot检测Bax、Bcl-2等凋亡相关分子的表达;7.通过生物信息学分析技术,利用数据库分析RB1/E2F1与肿瘤糖酵解通路相关分子的相关性;8.收集过表达RB1后的HCC细胞培养上清,通过观测培养基颜色、检测上清中葡萄糖和乳酸含量,测定RB1对HCC细胞葡萄糖摄取和乳酸生成的影响,同时通过qPCR、Western Blot和Seahorse检测HCC细胞糖酵解通路相关分子的表达及糖酵解能力的变化;9.通过Co-IP检测RB1是否与E2F1发生结合;10.通过数据库预测E2F1与糖酵解通路相关分子存在的潜在结合位点;11.通过ChIP和萤光素酶报告基因实验检测E2F1与HK2/GLUT1等糖酵解相关分子基因启动子区域的结合;12.使用过表达RB1的Huh7细胞对BALB/cA-nu裸鼠进行皮下荷瘤,以空载体处理的Huh7细胞为对照,定期检测肿瘤体积,同时通过qPCR、Western Blot检测肿瘤糖酵解通路相关分子的表达;13.使用过表达RB1的Hepa1-6细胞对C57BL/6小鼠进行皮下荷瘤,以空载体处理的Hepa1-6细胞为对照,定期检测肿瘤体积,并通过流式细胞术评估RB1对于小鼠免疫系统的影响。研究结果1.PCDH-RB1重组质粒构建成功测序结果显示PCDH-RB1重组质粒序列正确;通过慢病毒包装后感染HCC细胞,该载体能够在mRNA和蛋白水平明显上调RB1的表达,构建的重组质粒有效。2.过表达RB1可以抑制HCC细胞迁移和活力在HCC细胞中过表达RB1后,肝癌细胞的活力和迁移能力明显受到抑制。3.过表达RB1可以促进HCC细胞凋亡并调控细胞周期过表达RB1后,明显促进了 HCC细胞的凋亡,并且将细胞的周期阻滞在了G0/G1 期。4.过表达RB1抑制HCC细胞的干性HCC细胞过表达RB1后,细胞的克隆形成被显著抑制,同时SOX2、CD44等干性相关分子表达受到显著下降。5.过表达RB1能够显著抑制HCC细胞的糖酵解能力HCC细胞过表达RB1后,细胞的糖酵解能力受到显著抑制,其中HCC细胞的葡萄糖摄取和乳酸生成能力显著下降。6.E2F1能结合HK2/LDHA启动子区域并调控其表达与RB1解离后,游离的E2F1能够与HK2/LDHA的启动子区域发生结合,并且能够促进下游HK2/LDHA的表达。7.过表达RB1抑制荷瘤裸鼠的HCC生长过表达RB1后,裸鼠皮下肿瘤的生长受到显著抑制,同时糖酵解相关分子的表达也明显下降。8.过表达RB1抑制荷瘤小鼠的HCC生长并激活抗肿瘤免疫过表达RB1后,小鼠皮下肿瘤的生长受到显著抑制。另外,过表达RB1可以提升肿瘤浸润部位的T细胞比例,促进DC、巨噬细胞活化,同时外周淋巴器官及肿瘤浸润部位IFN-γ、TNF-α的分泌增加。结论与意义1.HCC细胞中RB1表达水平明显降低,其表达与肝癌患者生存期呈现正相关性。2.过表达RB1可以显著抑制HCC细胞的活力、迁移能力和干性,同时促进HCC细胞的凋亡水平,将HCC细胞的周期阻滞在G0/G1期。3.过表达RB1可以明显抑HCC细胞的糖酵解能力,其中包括葡萄糖摄取和乳酸生成能力,该机制是通过RB1-E2F1-HK2/LDHA轴实现的。4.在小鼠皮下肝癌模型中,过表达RB1会抑制肿瘤的生长,并且重塑肿瘤免疫微环境。5.该研究证明了 RB1与HCC发展的关系,提示RB1-E2F1-HK2/LDHA轴可能是有效治疗HCC的新靶点。