人类早老综合症(Werner syndrome, WS)是一种罕见的常染色体隐性遗传病,病人表现过早的衰老,同时伴随肿瘤的易感,因此WS被认为是研究衰老与肿瘤的最佳模型。为了构建人类wS的小鼠模型,研究者获得wrn基因敲除的小鼠,但是发现该小鼠并不表现人类wS的表型。进一步的研究发现,人类wS的细胞表现出端粒功能的异常,并且这是诱发wS的必要条件；与人类不同,小鼠体内有着端粒酶活性和更长的端粒,所以不显示wS的表型。据此,研究者在小鼠中同时敲除端粒酶和wrn基因,忠实再现了人类wS的表型。这种wS小鼠在G3～G5代端粒缩短引发端粒功能紊乱时,才会出现衰老表型,更进一步证明了端粒功能异常是诱发wS必不可少的。我们的前期研究发现,在wS的小鼠原代胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast, MEF) G5mTerc-/-Wrn-/-培养中,细胞很容易发生生长停滞并且衰老,但是部分衰老的细胞会在长时间的传代过程中发生衰老的逃逸,并形成永生化的细胞克隆。在这些永生化的细胞克隆中,有一些细胞株可以在SCID小鼠皮下形成肿瘤。由于在这些细胞中端粒酶是阴性的,所以形成的肿瘤属于ALT(Alternative lengthening of telomere)肿瘤。在这些形成肿瘤的永生化细胞中,过量表达p21蛋白,可以有效的抑制细胞的增殖,甚至诱导了细胞的衰老。这一结果表明了p21在诱导细胞衰老及wS ALT肿瘤抑制中的重要作用。p21是细胞周期抑制因子,活化的p53转录激活p21表达,是引发细胞衰老的重要分子通路；p21是p53肿瘤抑制作用中的主要决定因子,在肿瘤中的表达降低。为了进一步研究p21在细胞衰老和WS肿瘤抑制中的重要作用,我们利用基因型为p21-/-wrn+/-的小鼠进行杂交,制备了基因型分别为WT, Wrn-/-,p21-/-及p21-/-Wrn-/-的四种MEF细胞系,然后向四种不同基因型的MEF细胞分别转染TRF2的负显性抑制蛋白TRF2△B△M,引发端粒功能异常,模拟WS MEF细胞的端粒功能异常,通过对不同基因型细胞之间的相互比较,探索p21功能缺失对细胞衰老和肿瘤形成的影响。我们的研究在细胞水平上首次将端粒功能异常、Wrn功能缺失和p21功能缺失三者结合在一起进行研究。之前在小鼠水平的研究中发现,p21缺失并不会促进wrn因突变小鼠的肿瘤形成；另一项研究发现,p21的敲除可以延长端粒酶缺失引发端粒功能紊乱小鼠的寿命,但是并不会促进肿瘤的形成。这两个研究分别将p21缺失与端粒功能异常、p21缺失与Wrn功能异常结合在一起,得出了p21缺失不会促进肿瘤形成的结论；但是至今还没有在三者同时发生的背景下的研究报道。不能忽视的是,在小鼠体内,ws的表型需要同时具备端粒功能异常和Wrn功能异常,二者是缺一不可的。因此,我们的研究更能准确的反映p21在端粒功能异常和Wrn功能异常引发衰老和肿瘤中的重要作用。主要的研究结果如下：首先对WT,Wrn-/-,p21-/-及p21-/-Wrn-/-四种基因型细胞增殖能力进行了比较：一、运用结晶紫染色的方法测定了四种细胞在其传代早期(passage number(P)=5)的生长曲线,结果显示p21缺失的两种细胞(p21-/-和p21-/-Wrn-/-)生长速率明显高于wT和Wrn-/-细胞：二、利用免疫蛋白印迹方法检测了增殖相关蛋白PCNA (Proliferative Cell Nuclear Antigen,增殖细胞核抗原)在四种细胞早期和晚期的表达量。结果表明,在p21缺失的两株细胞中,PCNA在细胞传代的晚期仍有较高的表达水平,而在WT和Wrn-/-细胞晚期则明显降低。三、对晚期Wrn-/-,p21-/-及p21-/-Wrn-/-三种细胞进行了衰老相关的p半乳糖苷酶染色,发现Wrn-/-细胞晚期时蓝染的阳性细胞数明显高于p21缺失细胞p21和p21-/-Wrn-/-).我们还对过表达TRF2△B△M的Wrn-/-,p21-/-及p21-/-Wrn-/-三种细胞进行了衰老相关的β半乳糖苷酶染色,同样发现Wrn-/-+TRFΔBΔM细胞晚期时蓝染的阳性细胞数明显高于p21-/-+TRFΔBΔM和p21-/-Wrn-/-+TRFΔBΔM两种细胞。以上结果显示,,p21的缺失可以提高细胞增殖能力,并且使细胞逃逸端粒功能异常(包括Wrn缺失引发的端粒功能异常或引入TRFΔBΔM引发的端粒功能异常)引发的衰老。然后对p21缺失细胞逃逸衰老的可能机制进行了探讨：第一,p21缺失降低DNA损伤调控反应(DNA damage checkpoint response, DDR)可能是细胞逃逸衰老的原因之一。我们研究发现,p21缺失细胞中p16和p19表达明显低于Wrn缺失细胞,尤其是p21-/-Wrn-/-晚期细胞,说明p21缺失可以降低由于Wrn功能异常引发的DDR上调；p21-/-细胞可以通过降低TRFΔBΔM表达控制DDR水平：蛋白免疫印迹和荧光染色标记TRFΔBΔM的结果均显示,TRFΔBΔM表达逐渐降低,对DDR中相关蛋白的检测发现,随着TRFΔBΔM表达受到抑制,p53,p19以及损伤相关蛋白γ-H2AX的表达均有明显的降低,说明p21缺失可以降低由于端粒功能异常引发的DDR上调。第二,p21缺失提高DNA复制和修复潜能可能是细胞逃逸衰老的原因之一。引发细胞衰老的最主要因素就是DNA损伤,DNA修复可以降低DNA损伤的形成和积累,阻止细胞衰老。PCNA不仅可以促进DNA的复制,还可以参与许多DNA修复的过程,包括碱基错配修复,碱基外切修复等,而p21可以竞争结合PCNA,阻止PCNA参与到DNA修复中。我们研究发现,p21缺失细胞晚期仍有较高的PCNA表达量,说明细胞具有较高的DNA复制和修复的潜能。为了进一步验证我们的猜测,我们向细胞中过量表达TRF2△B△M引发端粒损伤,结果发现,在遭受端粒DNA损伤时,wT细胞PCNA表达没有变化,而p21缺失的细胞PCNA明显升高。以上结果表明,p21缺失可以提高细胞DNA修复潜能。第三,p21缺失提高细胞染色体加倍的机率,可能是细胞逃逸衰老的原因之一。肿瘤细胞中染色体具多倍性与非整倍性,细胞最初染色体的增倍是细胞继续增殖的必要条件之一。染色体核型分析发现,wT晚期细胞染色体增倍的细胞比例为12.5%,p21-/-期细胞为65.9%,p21-/-Wrn-/-晚期细胞为52.2%,这一结果表明,p21的缺失显著提高了细胞染色体增倍的机率,而且这些增倍的细胞,绝大多数是四倍体的形式。我们随后对过量表达TRF2△B△M的p21-/-和Wrn-/-p21-/-细胞进行了染色体核型分析,发现端粒损伤进一步提高了p21--细胞染色体增倍的比例,高达82.2%。但是,在Wrn-/-p21-/-细胞中染色体增倍的比例并没有升高,甚至有所降低,提示端粒损伤和Wrn蛋白功能在p21缺失引发染色体加倍过程中发挥重要作用。进一步研究发现,在p21--晚期细胞中,p16的表达水平明显高于wT晚期细胞,表明p21缺失细胞在晚期诱导了p16的表达,然而这些细胞仍然可以逃逸细胞衰老；另外,在瞬时过表达TRFΔBΔM的细胞中,p21-/-细胞p16的表达水平明显高于wT细胞。上述结果提示在p21缺失时,p16的单独升高并不能阻止细胞的衰老。我们进一步研究发现,p16的升高与染色体的加倍存在一定的正相关性：p21-/-晚期细胞中p16的表达量明显高于wT晚期细胞,染色体增倍的比例也远高于wT细胞(65.9%VS12.5%)；瞬时过表达TRFΔBΔM的p21-/-细胞与p21-/-对照细胞相比,p16的表达水平有明显的升高,染色体核型分析结果显示,p21-/-对照细胞染色体增倍的比例为65.9%,而过表达TRFΔBΔM的p21--细胞染色体增倍比例为87.2%,发生了明显的升高。这些结果均表明,p21-/-细胞中p16的表达升高可能是伴随染色体增倍所发生的应激反应。我们将p21-/-+TRF2△B△M的细胞继续传代,以期在细胞水平确定p21缺失在延长TRF2△B△M引发端粒功能异常的细胞寿命的同时,是否导致肿瘤的发生,以及在这个过程中细胞的基因改变。研究发现,p21-/-细胞可以通过降低TRF2△B△M表达来降低DDR,但是当细胞传代至晚期,细胞中p19的表达量突然出现了明显的升高,γ-H2AX和p53的表达也有所恢复。我们对这部分晚期细胞的p53基因进行测序发现,p53发生了点突变C138W。我们对晚期细胞进行了染色体核型分析,发现p53突变增加了基因组的不稳定性。进一步,我们通过Transformation实验和SCID小鼠和裸鼠皮下注射的方法对晚期p53突变细胞的致瘤性进行检测。结果发现,虽然细胞具有较强的单细胞形成克隆能力,但是形成克隆较小且并不能在小鼠皮下诱导肿瘤形成。以上结果证明,在小鼠MEF细胞水平上,p21的缺失可以延长TRFΔBΔM引发端粒功能异常的细胞的寿命,但是并不导致细胞的肿瘤化,与最近Rudolph等在小鼠水平上的报道一致。我们将Wrn-/-p21-/-+TRFΔBΔM细胞继续传代,研究在多重端粒功能异常下细胞的命运以及p21在其中发挥的重要作用。在免疫蛋白印迹实验中我们发现,虽然TRFΔBΔM表达量在Wrn-/-p21-/-+TRFΔBΔM细胞传代中也出现逐渐的降低,但是DDR的相关分子却不断的上升,表现出损伤的累积,显示出越来越高的选择压力：p53,p19,p16和PCNA等蛋白分子表达水平都有一个逐渐升高的趋势。在过表达TRFΔBΔM的Wrn--p21--中期细胞中,磷酸化p53的表达量突然有了明显的升高,说明此时激活了p53的功能!而且在这个节点上,其他损伤应激相关的蛋白也达到一个很高的水平,如γ-H2AX,p19,p16,p53和PCNA.让人感到意外的是,细胞此时的增殖能力突然增强,几乎没有衰老的细胞。通过对p53检测,我们发现细胞此时发生了p53点突变R27OL!Wrn导致了p21+TRFΔBΔM细胞中端粒损伤的不断积累,从而加速了p53的突变。我们对晚期p53突变细胞进行了肿瘤化检测,结果发现细胞具有较强的单细胞形成克隆的能力,形成克隆较大,并且可以在SCID小鼠和裸鼠皮下形成肿瘤。我们对肿瘤组织进行培养,得到肿瘤细胞。肿瘤组织和肿瘤细胞p53测序结果显示均含有相同的p53点突变R270L。在肿瘤组织的病理分析后,我们确认该肿瘤性质为肉瘤。以上结果证明,p53突变细胞具有致瘤性。我们对肿瘤组织和肿瘤细胞进行了免疫蛋白印迹实验,发现均有较高水平的p19和PCNA。但是在肿瘤组织中并没有高表达的p53,p-p53,p16等蛋白出现,而在肿瘤细胞中这些蛋白分子有很高的表达量,说明体外培养环境有别于肿瘤组织在体内的环境。在Wrn-/-p21-/-+TRFΔBΔM细胞中,p53突变同样提高了基因组的不稳定性,并且明显高于p21-/-+TRFΔBΔM晚期突变细胞,表现为多倍性与非整倍性增强,染色体融合(高达36.6%)、断裂数增加(14.6%),双微体出现等等。但是在肿瘤组织培养的肿瘤细胞中染色体的不稳定性明显改善,表现为更少的融合(12.1%),几乎没有断裂和双微体的出现；染色体虽然依旧表现出多倍性与非整倍性,但是染色体的数目稳定在40～80之间,比例高达69%,染色体数目大于160的细胞数很少,只占到3.4%。这一结果说明在肿瘤形成过程中,基因组的不稳定性得到了一定的修复,并使染色体数目和结构趋于稳定。TRFΔBΔM引发的端粒功能异常虽然在一定程度上可以模拟端粒酶敲除引发的端粒功能异常,但是仍然存在一定的差异,例如过表达TRFΔBΔM的p21缺失细胞中端粒酶是正常的,端粒会受到端粒酶的调控。为了进一步验证p21缺失对wsALT肿瘤形成具有促进作用,我们需要在端粒酶阴性的MEF细胞中验证我们的结果。我们之前在wS小鼠原代MEF细胞G5mTerc-/-Wrn-/-培养中发现,细胞很容易发生生长停滞并且衰老,但是部分衰老的细胞会在长时间的传代过程中发生衰老的逃逸,并形成永生化的细胞克隆。在这些永生化的细胞克隆中,有一些细胞株不能在SCID小鼠皮下形成肿瘤,这些不能形成肿瘤的永生化细胞中,p21的表达水平升高。我们选取了其中一株不形成肿瘤的永生化细胞395-6B-1,然后向该细胞中转入p21的特异性shRNA来降低p21的表达水平(同时转入空载体作为对照),并通过对细胞致瘤性的检测,来研究p21在端粒酶阴性细胞WS MEF G5m Terc Wrn中的抑癌作用。我们将395-6B-1+p21-shRNA细胞注射到SCID小鼠皮下,发现这株细胞可以在SCID小鼠皮下形成肿瘤,由于该细胞端粒酶是阴性的,因此形成的肿瘤为ALT肿瘤。这一结果证明了p21在WS MEF细胞中具有抑制ALT肿瘤发生的重要作用。综上所述,我们首次将端粒功能异常、Wrn功能缺失和p21功能缺失三者结合在一起进行研究,主要研究结果如下：一、p21功能缺失可以延缓细胞衰老,延长细胞寿命,主要的分子机制包括：DDR降低,DNA修复潜能提高,染色体增倍等。二、p21缺失细胞中p16的单独升高并不足以引发细胞衰老,表明p21在细胞衰老中发挥主导作用。p16的升高与染色体增倍正相关。三、在过表达TRFΔBΔM单独引发的端粒功能异常下,p21的缺失并不会引发肿瘤的形成,而是延长细胞寿命,符合了最近Rudolph等在小鼠水平的研究结果。四、在过表达TRFΔBΔM和Wrn功能缺失同时引发的多重端粒功能异常下,p21的缺失可以通过p53突变导致肿瘤的发生,符合了肿瘤发生的复杂性特点。这一结果使我们对p21在肿瘤抑制中的作用有了更深的理解。五、来源于WS MEF的非肿瘤永生化细胞中,p21的敲低可以导致细胞肿瘤化,进一步验证了p21在WS ALT肿瘤中的抑制作用。