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根据2012年全球癌症数据研究,胃癌的发病率位居全球第四,每年全球有超过95万例新发胃癌病例,胃癌的病死率则在癌症导致的死亡中位居第二,每年约有72万例胃癌患者死亡。尽管对于胃癌的流行病学、病理学、分子机制、治疗手段及策略有着越来越多的成果,但我国早期胃癌诊断率很低,严重影响患者的预后,因此寻找胃癌早期诊断的分子标志物以及治疗策略十分重要。 miRNA是一类大小约21-25核苷酸的非编码小RNA,能够通过靶向目的基因的3非编码区而抑制基因的表达。在不同肿瘤中,miRNA起着促癌基因或者抑癌基因的作用,在肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移、干性等肿瘤恶性生物学行为中发挥截然不同的作用。miRNA常作为肿瘤早期诊断、判断预后的生物标志物,同时也为肿瘤的治疗提供方向。近来研究发现 miR-335在不同肿瘤中抑癌因子或者促癌因子的作用,在胃癌、乳腺癌、膀胱癌等肿瘤中miR-335的表达是下调的,而在结肠癌中miR-335呈现高表达现象。在胃癌中,miR-335对于细胞恶性生物学行为的调控及其机制的研究很少,本研究拟探讨miR-335对胃癌细胞恶性生物学行为的影响,并探讨其潜在作用机制。 第一部分 miR-335在胃癌组织及胃癌细胞系中的表达情况 目的: 探讨miR-335在胃癌组织中及胃癌细胞系中的表达。 方法: 通过qRT-PCR对miR-335在胃癌组织及其配对癌旁正常组织中、胃癌细胞系及正常胃粘膜上皮细胞中的表达进行检测。 结果:在胃癌组织及胃癌细胞系中miR-335的表达明显下调,在T3-4期及转移的胃癌组织中miR-335的表达更低。 第二部分 miR-335对胃癌细胞生物学作用的影响 目的: 通过构建过表达和封闭miR-335的胃癌稳定细胞株,检测miR-335对胃癌细胞恶性生物学行为的影响。 方法: 1.构建SGC-7901过表达miR-335、BGC-823封闭miR-335细胞系及相应的阴性对照细胞系。 2.CCK-8、EdU实验及构建裸鼠皮下成瘤模型检测miR-335对胃癌细胞增殖能力的影响。 3.transwell小室法及构建裸鼠肺转移瘤模型法检测miR-335对胃癌细胞转移能力的影响。 4.悬浮成球试验、流式细胞术检测CD44+/EpCAM+细胞比例、构建裸鼠皮下成瘤模型检测miR-335对胃癌细胞干性的影响。 结果: 1.转染过表达miR-335慢病毒后SGC-7901细胞系中miR-335的相对表达量较阴性对照组细胞显著上升;转染封闭miR-335慢病毒后的BGC-823细胞系中miR-335的相对表达量较阴性对照组细胞明显下降。 2.CCK-8法显示过表达miR-335组细胞较阴性对照组吸光度明显减少,封闭miR-335组细胞较阴性对照组吸光度明显增加。EdU实验显示过表达miR-335组细胞较阴性对照组EdU阳性细胞率明显降低,封闭miR-335组细胞较阴性对照组EdU阳性细胞率明显增加。裸鼠皮下成瘤模型表明过表达miR-335组细胞瘤体体积较其阴性对照组明显下降。 3.Transwell小室实验显示过表达miR-335组细胞较阴性对照组穿膜细胞数明显下降,而封闭miR-335组细胞较阴性对照组穿膜细胞数明显增加。裸鼠肺转移瘤模型显示过表达miR-335组肺转移瘤数目较其阴性对照组明显下降。 4.悬浮成球实验显示过表达miR-335组细胞较阴性对照组成球数明显下降,封闭miR-335组细胞较阴性对照组成球数明显增加。流式细胞术显示过表达miR-335组细胞较阴性对照组CD44+/EpCAM+阳性细胞率明显下降,封闭miR-335组细胞较阴性对照组CD44+/EpCAM+阳性细胞率明显增加。裸鼠皮下成瘤模型表明过表达miR-335组细胞成瘤率较其阴性对照组明显下降. 第三部分 miR-335调控胃癌细胞恶性生物学行为的机制 目的: 探讨miR-335调控胃癌细胞恶性生物学的潜在机制。 方法: 1.运用生物信息学软件预测miR-335的靶基因,利用双荧光素酶报告实验验证miR-335的靶基因。 2.利用Western Blot检测Oct4、AKT、pAKT的表达。 结果: 1.生物信息学软件预测Oct4为miR-335的靶基因。双荧光素酶报告实验验证了miR-335能靶向Oct4。 2.Western Blot实验显示过表达miR-335组细胞较阴性对照组Oct4、AKT及pAKT表达明显下降,封闭miR-335组细胞较阴性对照组Oct4、AKT及pAKT表达明显增加。 结论: 1.miR-335在胃癌细胞系及胃癌组织、T3-4期、转移组织中表达下降。 2.miR-335能够抑制胃癌细胞的增殖、转移、干性。 3.miR-335可通过抑制Oct4的表达调控AKT的磷酸化从而发挥其抑制胃癌恶性生物学行为的作用。