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研究背景及目的冠脉无复流现象是严重影响急性冠脉综合征患者预后的临床挑战之一。不同程度的冠脉无复流现象广泛存在于接受冠脉血管再通治疗的患者当中，而2型糖尿病则明显加重无复流的严重程度。已有的临床研究发现，由脂肪细胞分泌脂联素（Adiponectin APN）显著减少而形成的低脂联素血症（Hypoadiponectinemia），可导致罹患冠心病的风险大大增大，是冠心病的独立危险因素。在2型糖尿病患者当中，循环脂联素水平显著下降。同时，相关基础研究显示：脂联素分泌减低，参与了由肥胖诱发的胰岛素抵抗的形成，可以导致2型糖尿病心肌组织缺血/再灌注易损性增加，使脂联素的心肌保护作用显著减低。作为冠脉微循的缺血/再灌注损伤，2型糖尿病时加重的无复流与脂联素的心血管保护作用减弱是否相关，目前尚缺乏直接的研究实验依据。本研究试图从整体、组织到细胞水平逐步论证脂联素减低是否导致2型糖尿病时冠脉无复流损伤加重；进一步探讨脂联素对冠脉微循环的保护作用，以加深对无复流机制的理解，为临床完善冠脉无复流的治疗策略提供实验依据。研究方法1.成年2型糖尿病模型大鼠冠脉无复流模型制备1)连续高脂高糖饲喂诱导2型糖尿病大鼠建立选择6周健康雄性SD大鼠75只，分为正常饲喂对照组10只，60%高脂高糖饲料饲喂组65只，屏障环境内连续饲喂32周，定期监测体重，空腹血糖，空腹胰岛素及血清脂联素水平。8周后每4周进行腹腔注射糖耐量实验，选择稳态模型胰岛素抵抗指数升高及腹腔注射糖耐量实验异常，作为2型糖尿病模型成功检测指标。2)2型糖尿病大鼠冠脉无复流模型制备使用上述造模成功的2型糖尿病模型鼠及普通饲料饲喂大鼠，实验分组如下：①伪手术组（Sham组）（n=5）：31周末给予鼠尾静脉注射生理盐水0.5ml；②正常对照组（Normal组）（n=5）：31周末给予鼠尾静脉注射生理盐水0.5ml；③糖尿病大鼠组（DM组）（n=7）：31周末给予鼠尾静脉注射生理盐水0.5ml；④糖尿病大鼠+球状脂联素功能片段（globular domain ofadiponectin gAd）干预组（DM+gAd组）（n=6）：31周末给予鼠尾静脉注射重组球状脂联素，20μg/kg。以上各组大鼠通过结扎冠脉左前降支，缺血1.5小时/再灌注12小时，建立心肌缺血/再灌注损伤模型；通过冠状动脉注射荧光微球（直径10μm），硫磺素S染色法及伊文思蓝染色法，分别测定无复流面积/缺血面积百分比，确定无复流严重程度，同时经颈动脉插管测定左室内压评估大鼠心功能。同时测定血清脂联素（APN），内皮素-1（endothelin-1ET-1），细胞间粘附分子-1（intracellularadhesion molecule-1ICAM-1），血管内皮粘附分子-1（vascular cellular adhesionmolecule-1VCAM-1）水平，评估血管内皮损伤情况。2.2型糖尿病大鼠离体血管环实验分离连续高脂高糖饲喂32周2型糖尿病大鼠胸主动脉及冠状动脉三级分支，实验分组如下：①正常对照组（Normal组）（n=5）；②2型糖尿病大鼠大鼠组（DM组）（n=5）；③2型糖尿病大鼠大鼠+球状脂联素功能片段孵育组（DM+gAd组）（n=5）。离体血管置于含2μg/ml球状脂联素功能片段（DM+gAd组）或vehicle（Normal组，DM组）的培养皿中并在细胞培养孵化器中孵育4h，利用DMT张力测定仪和PowerLab数据采集系统，通过离体微血管环技术检测离体血管内皮依赖性的血管舒缩功能。3.高糖刺激后人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cellHUVECs）缺氧/复氧模型制备原代培养人脐静脉内皮细胞，在高糖刺激后建立缺氧/复氧模型。实验分组如下：①空白对照组（vehicle组）；②缺氧3h/复氧1h组（H/R组）；③10mmol/L高糖刺激组（G组）；④10mmol/L高糖刺激+缺氧3h/复氧1h组（G+H/R组）；⑤10mmol/L高糖刺激+缺氧3h/复氧1h+球状脂联素功能片段组（G+H/R+gAd组）。③~⑤组加入10mmol/L高糖孵育48h。第⑤组于造模前加入gAd干预24h，使细胞培养液中终浓度分别达到2μg/mL。空白对照组、模型对照组不予任何药物处理。检测各组HUVECs上清液中的ET-1、ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的分泌情况。研究结果1.成年2型糖尿病模型大鼠冠脉无复流模型1）2型糖尿病大鼠血浆脂联素水平在长期高脂高糖饲喂过程中出现先增高而后持续减低，与胰岛素的变化趋势一致，但时间略迟于胰岛素。2）32周末血浆ET-1、粘附分子（ICAM-1、VCAM-1）水平显著升高。于31周末经给予外源性球状脂联素功能片段（gAd）干预1周后，可显著减低血清ET-1水平。3）2型糖尿病大鼠缺血/再灌注后无复流面积增大（ANR/AAR：48.64±1.928%vs.35.48±4.308%，P0.05），心功能受损明显。血清粘附分子（ICAM-1、VCAM-1）水平升高。4）外源性球状脂联素功能片段干预治疗后，2型糖尿病大鼠缺血/再灌注后无复流面积减小（ANR/AAR：28.48±1.441%vs.48.64±1.928%，P0.05）。灌注改善，心功能明显改善，血浆ET-1、粘附分子（ICAM-1、VCAM-1）水平减低。5）在2型糖尿病大鼠缺血区域组织内，无复流区的APN蛋白含量显著低于再灌注区域。2.2型糖尿病模型大鼠离体血管环实验1）胸主动脉内皮依赖性血管舒张功能：2型糖尿病鼠内皮依赖性血管舒张功能最大舒张度较正常对照组显著下降（70±3.57%vs.93±6.12%，P0.05），而2型糖尿病鼠血管环用脂联素孵育4h后，血管舒张功能明显改善，血管舒张度为（70±3.57%vs.81±5.66%，P0.05）。2）胸主动脉非内皮依赖性血管中舒张功能：各组之间并无明显差异。3.高糖刺激HUVECs缺氧/复氧模型与空白对照组（Vehicle）相比，缺氧/复氧（H/R）组、高糖（G）组、高糖联合缺氧/复氧处理（G+H/R）组的ET-1, ICAM-1, VCAM-1, E-selectin水平均明显升高；球状脂联素功能片段预处理后，该组（G+H/R+gAd）与G+H/R组相比，ET-1, ICAM-1, VCAM-1, E-selectin水平出现明显降低结论2型糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注后无复流程度加重与血浆脂联素水平降低有关，而外源性给予球状脂联素功能片段，可以有效减轻2型糖尿病大鼠冠脉无复流损伤，改善心功能；脂联素的微循环保护作用可以通过降低内皮细胞粘附分子的分泌，发挥血管内皮保护作用而实现。