细胞死亡是多细胞生物的重要生命过程之一，在生物体的发育、防御及自稳过程中起重要作用。死亡细胞表面表达的特异性标志物如磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS），使得它们能快速被吞噬细胞所吞噬，并引起相应的免疫学事件。吞噬细胞识别的死亡细胞可分为两种：凋亡细胞和坏死细胞。凋亡（apoptosis）是一种程序化的、需要消耗能量的、不引起组织炎症反应和损伤的细胞死亡过程，坏死是（necrosis）一种非程序化的、不需要消耗能量的、引起组织炎症反应和损伤的细胞死亡过程。近10年的研究证明，两种不同死亡方式的细胞在自身免疫、肿瘤免疫、感染免疫以及移植免疫等过程中均发挥重要的作用。 对于死亡细胞调节免疫反应的机制，作者的导师首次提出了“细胞死亡方式”免疫识别理论模型，认为凋亡细胞诱导免疫耐受而坏死细胞诱导免疫应答。我们既往的研究表明：凋亡细胞能够抑制T细胞活化、延长移植物存活并诱导免疫耐受。文献报导坏死细胞能够活化免疫系统，增强抗感染能力。但是对于不同方式死亡细胞如何调控免疫反应，尤其是其对吞噬细胞功能的影响仍不清楚。 在革兰氏阴性细菌感染时会释放大量脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）进入血液循环。已知LPS可以激活巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1（interlukin-1，IL-1）、白细胞介素6（interlukine-6，IL-6）、白细胞介素8（interlukine-8，IL-8）等多种炎症介质，诱发全身炎症反应综合症。由于炎症部位往往同时存在广泛的细胞坏死和细胞凋亡，那么在细菌感染、细菌代谢产物存在的情况下，坏死细胞或凋亡细胞是否会调控细菌感染所引起的免疫反应呢？为此，我们拟首先通过体外研究，以炎性细胞因子（TNF-α和IL-6）分泌为指标，探讨不同方式死亡细胞本身以及在LPS刺激下对吞噬细胞功能的影响。 目的： 研究和比较不同模式死亡细胞被吞噬后对巨噬细胞分泌炎性细胞因子的调节作用，并阐明其可能的分子机制，为“细胞死亡方式免疫识别模型”这一假说提供实验依据。 方法： 1.小鼠巨噬细胞株RAW264.7的培养 小鼠巨噬细胞株RAW264.7，由南方医科大学病理生理学教研室姜勇教授馈赠，用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基在37℃、5% CO2环境中培养。 2.EL-4细胞的培养 小鼠T淋巴细胞株EL-4，由南方医科大学免疫学教研室富宁教授馈赠，用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2环境中培养。 3.小鼠腹腔巨噬细胞的分离和培养 取6周左右的Balb/c小鼠，腹腔注射1ml无菌液体石蜡，3-4天后放血处死小鼠，无菌PBS反复灌洗腹腔，吸出渗液，用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基洗涤3次后，37℃、5% CO2环境中培养。 4.凋亡和坏死细胞的制备 无菌操作取Balb/c小鼠胸腺并分离淋巴细胞，用完全培养基RPMI-1640调整细胞浓度为1×106/ml。 诱导小鼠胸腺细胞凋亡条件：培养皿直径6cm，含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基4ml，地塞米松（Dexamethasone，Dex）浓度5×106M，孵育时间6h。 诱导EL-4细胞凋亡条件：培养皿直径6cm，含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基4ml，波长310nm的紫外线（ultraviolet ray，UV）灯管下10cm处照射60min，孵育时间16h。 诱导小鼠胸腺细胞及EL-4细胞坏死条件：无血清RPMI-1640培养基4ml，56℃水浴加热60min。 收集处理后的细胞检测凋亡/坏死率，按Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒的操作说明书进行。 5.建立巨噬细胞和死亡细胞的共培养模型 在96孔板上种植RAW264.7细胞或小鼠腹腔原代巨噬细胞，分为3组，即对照组、凋亡细胞处理组（凋亡组）和坏死细胞处理组（坏死组）。对于凋亡组和坏死组，将巨噬细胞分别与1：5比率的凋亡/坏死细胞共培养。而对照组以等体积完全培养基培养。37℃、5%CO2孵箱孵育18h后收集上清，-20℃保存。 6.建立巨噬细胞与死亡细胞和LPS作用下的共培养模型 在96孔板上种植RAW264.7细胞或小鼠腹腔原代巨噬细胞，分为3组，即对照组、凋亡组和坏死组，凋亡组和坏死组巨噬细胞分别与1：5比率的凋亡/坏死细胞共培养，对照组加入等体积完全培养基作为空白对照处理。共培养1h后，加入LPS，并调节终浓度为100ng/ml，37℃、5%CO2孵箱孵育18h后收集上清，-20℃保存。 7.多细胞因子的检测 以Bio-Plex悬浮芯片系统和小鼠细胞因子检测试剂盒检测不同处理组的细胞共培养物上清中细胞因子。 8.统计学分析 采用GraphPad Prism5.0统计分析软件对数据进行统计分析。采用t检验，比较实验组与对照组之间的差异。 结果： 1.4-6周小鼠胸腺可分离出细胞1-2×108。由于在前期研究中发现，对于小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的诱导，Dex诱导法明显优于UV，因此我们对Dex诱导方法进行了深入探讨。发现影响细胞凋亡的主要因素有：Dex浓度，细胞浓度，孵育时间。对Dex诱导法反复研究，发现制备早期凋亡细胞的最佳条件为：细胞浓度5×106/ml，Dex浓度5×10-6M，孵育时间6h。此条件诱导的凋亡细胞，应用流式细胞计数法得出早期凋亡率（44.512±3.565）%，晚期凋亡率/坏死率晚期凋亡细胞数为（8.753±3.276）%。 制备EL-4凋亡细胞的最佳条件为：310nm UV，照射距离10cm，照射时间60min，孵育时间16h。此条件诱导的凋亡细胞，应用流式细胞计数法得出早期凋亡率（27.975±0.728）%，晚期凋亡率/坏死率（46.727±5.987）%。 细胞坏死的诱导方法均为：56℃加热60min。应用流式细胞计数法得出坏死率（95.247±3.977）%（小鼠胸腺淋巴细胞）和（86.053±3.616）%（EL-4细胞）。 2.凋亡细胞能够抑制LPS作用下的巨噬细胞产生炎症细胞因子的能力。和对照组相比，凋亡细胞下调巨噬细胞分泌炎性细胞因子的能力（P<0.05）。而且，凋亡细胞处理过的巨噬细胞再予以LPS刺激，培养物上清中炎症性细胞因子TNF-α和IL-6分泌表达减少（P<0.05）。 3.坏死细胞能够诱导巨噬细胞产生炎症性因子。与对照组相比较，与坏死细胞共培养后的巨噬细胞，产生炎症性细胞因子的能力明显增强（P<0.05）。而且，坏死细胞处理后的巨噬细胞再用LPS刺激，巨噬细胞产生炎症性细胞因子如TNF-α和IL-6的量进一步增加，达到LPS单独作用时的两倍（P<0.05）。 结论： 1.Dex诱导小鼠胸腺细胞凋亡的最佳条件：在直径6cm的培养皿中加含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液4ml，Dex浓度5×10-6M，细胞浓度5×106/ml，孵育时间6h。UV诱导EL-4细胞凋亡的最佳条件：在直径6cm的培养皿中加含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液4ml，310nm UV，照射距离10cm，照射时间60min，孵育时间16h。加热法诱导两种细胞坏死的最佳条件：56℃加热60min。 2.在巨噬细胞的体外培养体系中，用凋亡细胞、LPS或两者联合应用进行处理，检测各组炎症细胞因子产生情况。结果显示，凋亡细胞能够抑制巨噬细胞在LPS刺激下所产生炎症性的细胞因子TNF-α和IL-6。因此，凋亡细胞抑制免疫反应，诱导免疫耐受可能与其巨噬细胞产生炎症因子有关。 3.在巨噬细胞的体外培养体系中，分别用坏死细胞、LPS或两者联合应用进行处理，检测各组炎症细胞因子产生情况。结果显示，与未经任何处理的对照组相比，坏死细胞和LPS均显著提高了巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的量。若坏死细胞与LPS联合应用，则两种炎性细胞因子的分泌进一步增加。这一发现提示，细菌感染时所伴有的细胞坏死，会导致强烈而持久的炎性反应，更有效地激活免疫系统产生抗感染免疫。