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背景：高迁移率族蛋白1(high-mobility group box-1protein, HMGB1)是一种高度保守的非组蛋白染色体结合核蛋白,HMGB1的表达量、细胞定位和亚细胞定位模式决定其作用。近期研究表明,HMGB1参与了自身免疫性脑脊髓炎的发生,同时当脊髓和脑损伤时HMGB1导致机体神经炎症,但在疾病发生、发展过程中脊髓组织HMGB1表达模式的动态变化仍不清楚。本研究为揭示HMGB1在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)病程中的作用提供了新的证据,局部阻断HMGB1缓解EAE临床症状和抑制CNS炎症提供了新的治疗思路。目的：阐明EAE疾病病程中成年小鼠脊髓组织HMGB1数量、细胞定位和亚细胞定位以及给予HMGB1拮抗剂后对EAE疾病的影响。方法：利用MOG35-55抗原肽免疫C57BL/6小鼠建立EAE模型,根据EAE的临床症状和疾病发展趋势将EAE划分为发病前期(Pre-onset)、发病初期(Onset)、高峰期(Peak)和慢性期(Chronic)四个时期。以正常C57BL/6小鼠作为对照。在EAE病程相应的时间点取材进行以下检测：1.通过蛋白印迹技术和免疫组织化学染色检测EAE病程中脊髓组织HMGB1表达。通过酶联免疫吸附试验检测EAE病程中不同体液(血清、脊髓组织间液和脑脊液)中HMGB1的水平。通过免疫组织化学染色和蛋白印迹技术检验脊髓组织中细胞核和胞浆的内源性HMGB1表达情况。通过免疫荧光双重染色和免疫组织化学染色观察了EAE病程中脊髓组织TLR4的动态表达和TLR4在CNS中细胞定位。同时,通过苏木素伊红染色检测EAE病程中脊髓炎性细胞浸润情况。2.通过免疫荧光双重染色观察HMGB1在正常成年小鼠脊髓组织、CNS细胞株(小鼠神经母细胞瘤细胞N2a、小鼠小胶质细胞BV2和脑胶质瘤细胞U87)的神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中的细胞核定位,体外原代培养神经元和星形胶质细胞进一步确定胞核HMGB1的表达。通过免疫荧光双重染色观察EAE病程中脊髓组织HMGB1表达模式的动态变化。3.观察HMGB1拮抗剂(甘草甜素(glycyrrhizin, GL))或中和性抗HMGB1单克隆抗体(neutralizing anti-HMGB1monoclonal antibody, HMGB1Ab))对EAE脱髓鞘的影响,通过预防性和治疗性腹腔注射GL、HMGB1Ab或侧脑室注射HMGB1Ab,评估EAE临床症状、病理特征、不同体液中HMGB1的水平、脊髓组织HMGB1的表达、CNS星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元的变化。流式细胞术检测腹腔给予HMGB1Ab处理后对脾脏Th1、Th17细胞数量的影响。结果：1.EAE病程中脊髓组织表达HMGB1增加：与Normal组相比较,EAE病程四个时期脊髓组织表达HMGB1总蛋白均显著增加,于Onset期达到最高峰。不同体液(血清、脊髓组织间液和脑脊液)中胞外HMGB1的水平增加；EAE高峰期脊髓细胞HMGB1从细胞核向胞浆转位；EAE病程中脊髓组织表达TLR4增加,神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞均表达TLR4。组织病理学检测发现脊髓组织中有炎性细胞浸润,特别是在EAE发病初期和高峰期。2.正常状态下脊髓组织部分星形胶质细胞和小胶质细胞的胞核表达HMGB1,少许神经元的胞核表达HMGB1; CNS细胞株(小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a)、小鼠小胶质细胞(BV2)、脑胶质瘤细胞(U87))的胞核表达HMGB1。同时,原代培养的神经元和星形胶质细胞进一步证实了细胞核表达HMGB1。然而,EAE病程中脊髓组织HMGB1总蛋白和胞外HMGB1水平升高,HMGB1阳性的星形胶质和小胶质细胞数量增加,伴随着胞外HMGB1水平升高,定居于脊髓前角和中央管周围区域的神经元核HMGB1向胞浆转位。3.体内实验结果显示,腹腔预防性给予GL不影响EAE发生、发展,腹腔治疗性给予GL能够缓解EAE临床症状,侧脑室治疗性给予HMGB1Ab处理几乎完全抑制EAE发生、发展。治疗性给予HMGB1拮抗剂GL或HMGB1Ab发挥有效的抗炎作用缓解EAE临床症状,减轻脊髓组织炎性细胞浸润和髓鞘脱失,降低不同体液中HMGB1水平和脊髓组织HMGB1表达,下调外周脾脏组织Th1和Th17细胞数量,抑制EAE脊髓组织中星形胶质细胞、小胶质细胞的活化,同时降低神经元的损伤。结论：本研究观察了EAE疾病发生、发展过程中脊髓组织HMGB1表达模式的动态变化,在疾病起病阶段阻断HMGB1能够缓解EAE临床症状,自身免疫性脑脊髓炎(人类多发性硬化症)疾病可以以HMGB1为潜在的治疗靶点。