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目的:应用噬菌体展示技术筛选新的肺癌特异性标志物,检测新标志物在肺癌组织中的表达水平及在血清中相应抗体的水平,验证新指标对肺癌的诊断和预后价值。
方法:利用噬菌体展示技术,将肺癌特异性cDNA文库表达到T7噬菌体载体上,文库表达产物先与5例正常对照组混合血清进行亲和淘洗,筛除正常表达基因,再与5例肺癌患者混合血清同样进行亲和淘洗,筛选肺癌特异性表达基因,如此经过反复4轮淘洗后,最终筛选得到表达肺癌特异性基因的噬菌体。然后,在这些噬菌体中,随机挑取94个单克隆噬菌体,进行PCR扩增,扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳,大于350bp的为阳性。将阳性标本PCR产物进行测序,测序结果通过NCBI的BLAST比对,以明确其基因位点,结合已有研究报道的结果,筛选出与肺癌相关性大的基因作进一步功能验证。经初步筛选,发现eEF2和CEP350是本研究中与肺癌发生发展相关性最大的2个基因。RT-PCR检测38例不同病理类型的肺癌病灶组织、癌旁组织eEF2和CEP350基因的表达,以明确eEF2和CEP350基因与肺癌的相关性;同时用ELISA法检测38例患者血清中eEF2和CEP350抗体的水平,以了解血清抗体表达与病灶组织mRNA表达的相关性;通过130例肺癌患者血清、24例肺部良性肿块患者血清和24例正常人血清eEF2和CEP350水平的比较,结合病理特征、临床分期、手术治疗情况分析,以明确eEF2和CEP350血清抗体的临床价值。
结果:(1)筛选到的噬菌体重组率为95%,经PCR扩增、测序、BLAST比对后找到16个与癌症相关的基因和9个功能未知的新基因,进一步结合文献报道等,发现eEF2和CEP350是本研究中与肺癌发生发展相关性最大的2个基因。(2)RT-PCR结果显示,eEF2在肺癌病灶组织中的阳性率为63.16%,癌旁组织阳性率为21.1%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05);CEP350在肺癌病灶组织中的阳性率为71.05%,癌旁组织阳性率为18.42%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05);(3)ELISA结果显示,eEF2抗体和CEP350抗体在肺癌患者血清中的阳性率显著大于正常对照组(P<0.05),38例肺癌患者组织与血清两指标的表达阳性无明显差异(P>0.05);(4)血清中eEF2、CEP350抗体及二者联合诊断肺癌价值的ROC曲线下面积分别为0.763、0.691、0.791,以45°斜率直线为基准,统计学分析显示,均具有显著性差异(P<0.01),提示其均可作为肺癌诊断的指标;(5)血清中eEF2抗体在肺癌转移组中的阳性率为40.24%,未转移组阳性率为29.17%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),提示eEF2可能与肺癌转移相关;血清中CEP350抗体在肺癌转移组中的阳性率为36.59%,未转移组阳性率为25.00%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),提示CEP350可能与肺癌转移相关:(6)eEF2抗体在肺癌Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期中阳性率分别为41.67%、47.06%、40.00%均显著高于肺癌Ⅰ期33.33%,均显著高于肺癌Ⅰ期,差异有统计学意义(P<0.05),CEP350抗体在肺癌Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期中阳性率分别为43.75%、49.02%、44.00%均显著高于肺癌Ⅰ期33.33%,差异有统计学意义(P<0.05),提示其与肺癌的临床分期可能具有相关性;(7)eEF2和CEP350抗体在各病理类型组间比较差异均无统计学意义(P>0.05),提示其与病理分型无明显的相关性;(8)肺癌患者血清eEF2抗体阳性率术前为33.33%,术后为19.05%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),提示eEF2抗体可以作为检测肺癌预后的标志物;CEP350抗体阳性率术前为28.57%,术后为23.81%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
结论:血清中eEF2、CEP350抗体对肺癌具有诊断价值:eEF2和CEP350抗体与肺癌的临床分期和转移相关性,而与病理分型无明显的相关性;eEF2抗体可以作为检测肺癌预后的标志物。